人胱抑素C大腸桿菌表達(dá)載體構(gòu)建及包涵體復(fù)性研究

何 慶，劉 帥，周海霞

（德州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 功能性生物資源開發(fā)與利用省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 德州 253023）

胱抑素C（CysC）又稱半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，可由人體中所有的有核細(xì)胞產(chǎn)生，其基因表達(dá)速度穩(wěn)定，且無組織特異性［1］.人CysC分子量較小，能夠通過腎小球自由濾過，在近曲小管被重吸收并降解，不返回血液，而腎小管上皮細(xì)胞并不向管腔內(nèi)分泌CysC，因此CysC是目前臨床廣泛采用的一種反映腎小球?yàn)V過率變化的理想標(biāo)志物［2-3］.目前國外對于人源性CysC蛋白晶體結(jié)構(gòu)以及純化手段研究較為成熟［4-5］，但國內(nèi)此類研究和報(bào)道較少，且國內(nèi)目前使用的CysC檢測試劑盒及其核心原料均由國外提供.鑒于CysC蛋白在臨床和檢驗(yàn)中的重要意義，有必要對人cysC基因表達(dá)及蛋白純化、復(fù)性進(jìn)行深入研究，本研究采用基因工程的方法構(gòu)建了人cysC大腸桿菌表達(dá)載體，并探討了CysC蛋白包涵體胞外復(fù)性的方法，為降低體外診斷試劑的成本，提高產(chǎn)品競爭力做出了一定的貢獻(xiàn).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒：大腸桿菌E.coli DH5α、BL21菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存，原核表達(dá)載體pET32a購自TaKaRa公司.

1.1.2 試劑：BamHⅠ與HindⅢ限制性內(nèi)切酶購自Promega公司；Taq DNA聚合酶、DNA連接酶購自TaKaRa公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自New England Biolabs公司；D人基因組DNA提取試劑盒、細(xì)菌DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購自O(shè)MEGA公司；十二烷基磺酸鈉、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）及各類抗生素購自Sigma公司；兔抗人CysC多克隆抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG、DAB染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；人cysC基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物序列：5’-CGGGATCCTCTCCGGGTAAACCGCCG-3’，下游引物序 列 ：5’-CCCAAGCTTAGCGTCCTGGCAGGTAGA-3’；8～14ku孔徑透析袋為德國Merck產(chǎn)品.

1.1.3 儀器：PCR擴(kuò)增儀、電轉(zhuǎn)化儀、核酸電泳儀、蛋白電泳儀為Bio-Rad產(chǎn)品；紫外分光光度儀為HITACHI產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)載體及菌株構(gòu)建：以人基因組DNA為模板克隆人cysC基因，回收純化目的片段，采用BamHⅠ與HindⅢ限制性內(nèi)切酶對目的片段進(jìn)行消化，獲得cysC基因片段.將cysC基因片段經(jīng)與BamHⅠ與HindⅢ限制性內(nèi)切酶處理的pET32a原核表達(dá)載體通過DNA連接酶鏈接，獲得重組表達(dá)載體pET32a-cysC.使用電轉(zhuǎn)化將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)菌株中，挑取平板陽性菌株進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定.同理，使用電轉(zhuǎn)化將經(jīng)鑒定的重組表達(dá)載體pET32a-cysC轉(zhuǎn)入E.coliBL21感受態(tài)菌株中，挑取陽性菌株進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定.

1.2.2 人CysC誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定：將經(jīng)鑒定的重組BL21-cysC菌株接種于100ml新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長中期時(shí)，加入0.4mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，4h后10000rpm離心培養(yǎng)液，棄上清.5ml PBS緩沖溶液重懸沉淀，并進(jìn)行超聲破碎，采用SDS-PAGE檢測破碎后上清和沉淀中人CysC蛋白表達(dá)情況.

1.2.3 人CysC蛋白純化及復(fù)性：擴(kuò)大培養(yǎng)并收集IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4h的重組BL21-cysC菌株，超聲破碎，通過鎳柱純化CysC蛋白包涵體及可溶性上清，采用透析法對純化產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性緩沖液1配方：20mmol/L Tris-HCl、1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、0.5mol/L精氨酸、1.33mmol/L還原性/氧化性谷胱甘肽、0.8mol/L脲，pH=8.0；復(fù)性緩沖液2 配方：20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、0.02%疊氮化鈉，pH=8.0.復(fù)性溫度控制在2～8℃.

1.2.4 復(fù)性后CysC蛋白免疫反應(yīng)性檢測：采用Western Blotting檢測復(fù)性后CysC蛋白免疫反應(yīng)性.

2 結(jié)果

2.1 cysC基因表達(dá)載體構(gòu)建

對重組E.coli DH5α菌株質(zhì)粒采用BamHⅠ與HindⅢ限制性內(nèi)切酶，結(jié)果陽性，證明cysC基因表達(dá)載體構(gòu)建成功.見圖1.

圖1 重組質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物電泳圖（通道1：pET32a-cysC；通道M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)）

2.2 重組BL21-cysC菌株誘導(dǎo)表達(dá)情況

從圖2可以看出，沉淀和上清中均有pET32a-cysC蛋白表達(dá)，且沉淀中表達(dá)量更高，表明pET32a-cysC蛋白大部分以包涵體形式存在，小部分可溶于上清中.

圖2 IPTG誘導(dǎo)重組BL21-cysC菌株表達(dá)CysC蛋白（通道M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；通道1：超聲破碎后沉淀物；通道2：超聲破碎后上清）

2.3 重組CysC蛋白純化和復(fù)性

采用Western Blotting檢測純化和復(fù)性后CysC蛋白，圖3中可見分子量約34kD大小的重組CysC蛋白，表明重組CysC蛋白具有一定免疫學(xué)活性.

圖3 純化后CysC蛋白檢測（通道M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；通道1：CysC蛋白純化產(chǎn)物）

圖4 復(fù)性CysC蛋白Western Blotting分析

3 討論

表達(dá)載體對基因表達(dá)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其活性具有很大的影響，并能影響蛋白質(zhì)純化及復(fù)性［6］.本研究采用pET32a作為cysC基因表達(dá)載體，采用IPTG誘導(dǎo)cysC表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)重組CysC在pET32a中盡管大多數(shù)為包涵體形式，但有部分以可溶性形式存在，這與李江峰等［7］報(bào)道CysC在pET28a、pCold1等表達(dá)載體中均已包涵體形式存在有差異.這種差異的實(shí)際益處在于可溶性重組CysC的后續(xù)純化和復(fù)性操作更為簡單.重組CysC蛋白包涵體形成至少與兩方面原因有關(guān)，一是CysC蛋白中存在兩個(gè)二硫鍵和較為復(fù)雜的β-片層結(jié)構(gòu)，真核生物蛋白在原核表達(dá)載體中表達(dá)及修飾過程中難以進(jìn)行正確折疊，造成疏水基團(tuán)暴露［8］；二是與表達(dá)載體使用的蛋白質(zhì)標(biāo)簽所具有的的功能有關(guān)，本研究采用的pET32a中使用的是His標(biāo)簽，分子量較小，有利于目標(biāo)蛋白的純化、分析，對其折疊并不會造成太大的影響，有助于在復(fù)性過程中獲得具有更高生物活性的蛋白［9］.

包涵體復(fù)性的目的是獲取有生物學(xué)活性的蛋白，是極為關(guān)鍵的步驟.本研究在復(fù)性緩沖液體系中引入還原性/氧化性谷胱甘肽的目的在于促進(jìn)重組CysC蛋白形成正確的的二硫鍵，在其他蛋白表達(dá)時(shí)可根據(jù)特定蛋白二硫鍵數(shù)量適當(dāng)調(diào)整還原性和氧化性谷胱甘肽的比例［10］.精氨酸能夠避免復(fù)性中重組CysC蛋白相互聚集，具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用.本研究通過Western Blotting檢測分析復(fù)性CysC蛋白的免疫學(xué)活性，結(jié)果顯示有部分重組蛋白表現(xiàn)出免疫學(xué)活性.提示本研究所采用的復(fù)性方法能夠一定程度地恢復(fù)重組蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性.

綜上，本研究成功構(gòu)建大腸桿菌cysC表達(dá)重組工程菌，經(jīng)純化、復(fù)性得到的重組CysC蛋白具有一定免疫活性，為今后cysC基因原核表達(dá)和復(fù)性提供了一定借鑒，在一定程度上為今后CysC的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供了一定方法學(xué)基礎(chǔ).