冷凍治療的研究

李鴻鵬，李鐵軍

(1.清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，北京 100084； 2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，遼寧 大連 116011)

近年來，冷凍治療已經(jīng)用于各種皮膚病變的治療，成為無法通過手術(shù)切除實(shí)體腫瘤治療的重要手段。冷凍治療作為一種新型局部治療方法，具有消融能力大、消融部位精確等超越射頻消融術(shù)、熱療等其他治療方法的優(yōu)點(diǎn)，可直接通過細(xì)胞壞死和凋亡、改變局部微循環(huán)和調(diào)節(jié)免疫等摧毀病變細(xì)胞，進(jìn)而清除皮膚病變和惡性腫瘤。冷凍治療不良反應(yīng)少，組織修復(fù)治療效果較好[1]。隨著冷凍治療設(shè)備的發(fā)展、冷凍消融技術(shù)的完善以及臨床經(jīng)驗(yàn)的不斷積累，冷凍治療在皮膚病和腫瘤治療中占據(jù)越來越重要的地位。冷凍治療的適用領(lǐng)域不斷擴(kuò)展，現(xiàn)通過闡述冷凍治療設(shè)備的發(fā)展與制冷劑使用的現(xiàn)狀，對目前廣泛使用的氬氦刀和新上市的康博刀冷凍治療原理和特點(diǎn)進(jìn)行對比，對國內(nèi)外冷凍治療的研究予以綜述，以期促進(jìn)冷凍技術(shù)治療效果的提高和治療領(lǐng)域的擴(kuò)大。

1 冷凍治療設(shè)備與制冷劑

1.1冷凍治療設(shè)備的發(fā)展 目前，臨床主要使用由一個儲冷罐和一個噴嘴組成的手持液氮噴霧設(shè)備，實(shí)施皮膚疾病的噴霧冷凍手術(shù)。隨著冷凍手術(shù)的廣泛應(yīng)用，現(xiàn)已開發(fā)自動化多探針冷凍設(shè)備。1998年美國Endocare公司成功研制出腫瘤治療設(shè)備-美國氬氦刀。在CT或B超引導(dǎo)下將氬氦刀頭經(jīng)皮準(zhǔn)確穿入腫瘤組織中心，可籍氬氣在刀尖急速絕熱制冷使腫瘤組織降至-100 ℃；隨即可籍氦氣在刀尖急速制熱使冰球解凍并急速升溫至50 ℃[2]。劉靜教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合海杰亞(北京)醫(yī)療器械有限公司自主研發(fā)出大型腫瘤治療設(shè)備——康博刀?？挡┑吨委熛到y(tǒng)最低溫度可達(dá)-196 ℃，最高溫度可達(dá)80 ℃以上[3]?？挡┑杜c氬氦刀都是通過高強(qiáng)度冷熱快速切換的方法，達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目的，但康博刀的整體工作性能顯著優(yōu)于氬氦刀，且探針與液氮的成本均較低[4]。目前，各種不同類型的冷凍治療設(shè)備均可用于臨床治療。

1.2制冷劑 雖然液態(tài)二氧化碳、一氧化二氮、氟利昂或氬作為制冷劑亦可用于臨床治療，但液氮仍是最常用的現(xiàn)代制冷劑。液態(tài)氬是在300個大氣壓下用焦耳-湯姆遜(Joule-Thomson，J-T)效應(yīng)冷卻探針尖端，即在探頭的熱交換室中通過1個限制孔的壓力來傳遞氣體。在J-T型裝置中，液態(tài)氬比液態(tài)氮的冷卻速度快，但溫度只有-130～-135 ℃，且冷凍后氣體回流會迅速加熱探針。在治療腫瘤的過程中，由于液態(tài)氬的冷凍能力較低，相較于液態(tài)氮的冷凍直徑，液態(tài)氬需要2倍的探針才能達(dá)到相同冷凍效果。但加壓氬氣冷卻的J-T型裝置不需要液氮真空絕緣材料儲存罐。氬氦刀屬于J-T型裝置，在300～500個大氣壓下工作的氬氣為稀有性超高壓氣體，獲取受限，手術(shù)實(shí)施中存在安全隱患；而康博刀為相變制冷型裝置，使用運(yùn)行壓力2～5個大氣壓的液氮，易于獲取，安全性和可操作性好[5]。J-T型設(shè)備中常用的另外兩種冷凍劑是液態(tài)二氧化碳和液態(tài)一氧化二氮，雖然已臨床使用多年，但缺乏足夠用于治療侵襲性癌癥或多探頭設(shè)備的冷凍能力。

2 冷凍治療技術(shù)

2.1冷凍治療方法 冷凍治療方法主要有棉簽涂抹、定點(diǎn)噴霧和探針介入3種，前兩種方法主要用于治療各種皮膚病，探針介入主要治療各種腫瘤。由于病毒可能在液氮中生存而污染制冷劑，故棉簽涂抹需要為每例患者單獨(dú)分配制冷劑，避免交叉?zhèn)魅綶6]。此外，棉簽涂抹的最大冷凍深度為2～3 mm，故不能用于深層病變的治療。定點(diǎn)噴霧是使用手持液氮噴霧單元實(shí)施的噴霧治療，主要有直接模式(直接噴灑病變中心)、螺旋模式(從病變的中心螺旋向外)和“畫筆”模式(將噴嘴從一側(cè)像漆墻一樣移至其他損傷部位)3種方式。手持絕熱塑料錐是對定點(diǎn)噴霧治療方法的改進(jìn)，將適當(dāng)大小的圓錐直接放置于病變區(qū)域，使制冷劑的噴霧區(qū)域限制于尖端暴露的部位，較單獨(dú)使用噴霧劑的凍結(jié)深度加深，制冷劑直接作用于目標(biāo)組織，可使冷卻速度較慢的制冷劑獲得深度冷凍和大面積冷凍的治療效果[7]。圓錐尖端的大小形狀各異，可在目標(biāo)組織形成多種凍塊。探針介入是采用探針進(jìn)行冷凍手術(shù)的治療方法，在腫瘤的深層組織中插入一根或多根探針，冷凍劑通過該針在壓力和湍流作用下回收，導(dǎo)致被治療的腫瘤深層組織內(nèi)形成冰球，經(jīng)過2次凍融循環(huán)，可消融85%的實(shí)體腫瘤，更深層或直徑更大的腫瘤則需進(jìn)行多次冷凍。康博刀與氬氦刀均為探針介入治療。

2.2冷卻速率 冷凍治療中，快速冷凍(>50 ℃/min的降溫速度)只發(fā)生在冷凍探針附近，距探針越遠(yuǎn)冷卻速率越低。距噴霧中心約1 cm處，冷卻速率只有10～20 ℃/min，且與噴頭溫度有關(guān)。冷凍治療腫瘤直徑>2 cm時，大多數(shù)組織不會被快速冷卻，但低冷卻速率似乎并不改變治療結(jié)果[8]。Farrant和Walter[9]認(rèn)為，決定細(xì)胞生存的主要因素是細(xì)胞在不同時間接觸到不同的熱量變化，而并不是冷卻速率。不同病變組織的冷凍時間亦有較大差別。

2.3溫度控制 細(xì)胞內(nèi)水體積很小，電解質(zhì)多樣性導(dǎo)致凝固點(diǎn)不同，甚至凝固點(diǎn)可低至-54.9 ℃(氯化鈣溶液的最低凝固點(diǎn))。在腫瘤治療或其他情況下，必須通過低溫保證組織破壞，考慮臨床應(yīng)用的誤差范圍，-50 ℃對所有腫瘤組織最安全。若使組織處于低于-50 ℃，冷凍持續(xù)時間無要求，而冰凍狀態(tài)(如高于-40 ℃)將會增加組織破壞。組織溫度高于-40 ℃時，解凍時間越長，溶質(zhì)效應(yīng)和冰晶體生長越明顯，對細(xì)胞的損傷越強(qiáng)[8]。

2.4凍融循環(huán) 反復(fù)凍融對腫瘤組織的破壞性更強(qiáng)，但對冷凍融化循環(huán)的具體間隔時間目前還未確定。Whittaker[10]在倉鼠口腔黏膜的周期性重復(fù)冷凍實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)冰晶在每次凍融循環(huán)的間隔時間中均會增加，從而提出較長間隔時間可增加冷凍效果，較長解凍時間會使細(xì)胞內(nèi)冰晶再晶體化而誘導(dǎo)細(xì)胞膜的滲透破壞。同時，持續(xù)的解凍將使組織處于低溫狀態(tài)，可為微循環(huán)的停滯提供足夠的時間。當(dāng)這一冷凍區(qū)域的熱量發(fā)生損耗，第2個凍融周期將會更加有效。但臨床實(shí)踐中，由于工作量較大，很難等待冰晶完全融解的長時間間隔。總之，最理想的破壞病變組織技術(shù)是快速冷凍組織，使其達(dá)到適當(dāng)?shù)牡蜏?，通過緩慢解凍延長持續(xù)時間，并重復(fù)凍融循環(huán)。

3 冷凍治療的簡單機(jī)制

3.1表觀現(xiàn)象 對皮膚病變實(shí)施冷凍噴霧時，在20～30 s的冷凍期后立即發(fā)生表觀變化，顯示白色冰場。在融化的幾分鐘內(nèi)，冰場邊緣的皮膚出現(xiàn)紫紅色并集中運(yùn)動，在皮膚表皮層和深層都與周圍健康皮膚有明顯界限，隨后深層組織變得更蒼白，表面形成的出血性水泡逐漸形成瘡痂，持續(xù)時間2～6周[11]。本質(zhì)上，低溫冷凍和低溫噴霧治療后的變化沒有區(qū)別，冷凍時立即能夠看到冰晶，但當(dāng)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)越來越多的嗜酸粒細(xì)胞時，第1次的細(xì)胞變化被延遲至大約30 min后；冷凍后1 h內(nèi)，可能沒有明顯的細(xì)胞死亡，但隨后幾小時內(nèi)可出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)化[12]。

3.2細(xì)胞壞死與凋亡 細(xì)胞壞死或基因調(diào)控的細(xì)胞死亡(凋亡)是冷凍直接導(dǎo)致細(xì)胞損傷的一種機(jī)制。Forest等[13]將一種人類肺腺癌細(xì)胞注射到小鼠背區(qū)的冷凍活體實(shí)驗(yàn)研究顯示，冷凍區(qū)域中心部分壞死，周圍區(qū)域有凋亡細(xì)胞，冷凍后2～8 h內(nèi)，細(xì)胞凋亡逐漸增加，且細(xì)胞凋亡發(fā)生在壞死區(qū)域以外的區(qū)域，但兩者之間的邊界尚不清楚，并在4 d后觀察到第2次壞死。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)說明了冷凍手術(shù)后細(xì)胞凋亡的時間，同時也闡明了體外和體內(nèi)研究的直接聯(lián)系。細(xì)胞凋亡或繼發(fā)性壞死是由冷凍過程中腫瘤細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境的變化導(dǎo)致的，如pH值改變、ATP 酶異常、線粒體損傷、電解質(zhì)紊亂、細(xì)胞器及細(xì)胞核破裂等[14]。

3.3直接細(xì)胞損傷 冷凍部位鏡下顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫粒。在組織學(xué)上，真皮表皮交界處出現(xiàn)水泡，表皮和相關(guān)黑色素細(xì)胞發(fā)生最大程度的死亡。胞外冰晶導(dǎo)致的細(xì)胞膜破壞，對固體腫瘤中緊密排列的細(xì)胞具有破壞作用。冷凍過程中，許多細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，破壞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。細(xì)胞外冰的變化和細(xì)胞外水的減少與溶質(zhì)濃度的增加有關(guān)。滲透壓的改變會導(dǎo)致細(xì)胞溶解、細(xì)胞體積減少和細(xì)胞膜破裂，其中一些破壞是不可逆轉(zhuǎn)的，且在融化過程中會加劇。盡管許多細(xì)胞剛解凍后看起來很正常，但很多細(xì)胞已經(jīng)死亡。大的冰晶比小的冰晶更具破壞性[12]。緩慢融化與冰的再晶化有關(guān)，比快速融化更具有破壞性。由于液態(tài)氮相對于其他制冷劑解凍緩慢，而緩慢解凍正是增加組織破壞的重要因素，故液態(tài)氮冷凍手術(shù)在臨床實(shí)踐中最有效。

3.4微循環(huán)停滯與再生 溫和的冷卻會使微血管的流動減少，在冬天皮膚變白時很容易觀察到，但這種效應(yīng)在小動脈較小。液氮冷凍后血管收縮，但在深度冷凍后血管開始擴(kuò)張，毛細(xì)血管和靜脈形成微血栓并逐漸固定在內(nèi)皮細(xì)胞上，故最終根本不流動，且可在-15 ℃以下觀察到這種效果，由于血小板聚集、血流瘀滯形成微血栓，導(dǎo)致細(xì)胞缺血壞死，細(xì)胞缺血壞死的程度將取決于凍結(jié)深度和橫向擴(kuò)散寬度[15]。臨床實(shí)踐中，靜脈和毛細(xì)血管可發(fā)生堵塞，但大動脈和小動脈很少發(fā)生。

組織被凍結(jié)，但基質(zhì)可能沒有較大的變化，這種體系結(jié)構(gòu)的保存對于修復(fù)非常重要。傷口愈合是活躍的過程，開始由于趨化因子引起的病變邊界處的炎癥反應(yīng)，在促炎素、組胺和細(xì)胞因子等炎性介質(zhì)的刺激下，早期發(fā)生中性粒細(xì)胞浸潤，隨后是單核細(xì)胞，且這種細(xì)胞浸潤緊隨著由冷凍組織的解凍導(dǎo)致的低溫和水腫而發(fā)生。有學(xué)者認(rèn)為，炎性細(xì)胞浸潤有助于細(xì)胞凋亡和組織破壞的發(fā)展[16]。當(dāng)肉芽組織逐漸形成，成纖維細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞，受損的膠原蛋白被新的膠原蛋白所取代。細(xì)胞浸潤有助于建立新的微循環(huán)系統(tǒng)，對組織的修復(fù)過程至關(guān)重要[17]。延遲愈合是低溫傷口的特征之一，無論是結(jié)痂還是吸收，清除壞死組織需要一定的時間。冷凍傷口愈合較切除傷口速度慢，但微循環(huán)系統(tǒng)得到了改善。

4 冷凍治療疾病的現(xiàn)狀

4.1皮膚病的冷凍治療 對皮膚病進(jìn)行冷凍治療已經(jīng)比較普遍，且治愈率較高，復(fù)發(fā)率在10%左右，見表1[18]。在小的基底和鱗狀細(xì)胞癌(直徑2 cm)治療中，Kuflik[19]總結(jié)了30年4 406種皮膚癌的臨床經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，冷凍治療的治愈率達(dá)98%。Nordin和Stenquist[20]對5年期間100例外耳冷凍手術(shù)治療結(jié)果的研究發(fā)現(xiàn)，只有1例復(fù)發(fā)，并認(rèn)為外科手術(shù)切除后再對病灶進(jìn)行冷凍治療是一種安全的治療方法。

4.2惡性腫瘤的冷凍治療 大多數(shù)腫瘤最好通過手術(shù)切除治療，便于進(jìn)行外科檢查和評估，保守的手術(shù)治療是進(jìn)行微創(chuàng)和消融治療(如冷凍手術(shù))。冷凍手術(shù)是一種安全有效的治療多種腫瘤的方法，主要應(yīng)用于全身各種實(shí)體腫瘤，包括肝癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、腎癌、骨骼的良惡性腫瘤、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、軟組織腫瘤、腎上腺癌、

表1 冷凍時間和良性、癌變前皮膚病的治療結(jié)果

腦膜瘤、子宮肌瘤等以及癌癥止痛等，現(xiàn)最常用于肝癌和肺癌[21-36]。癌變皮膚主要采用手持液氮噴霧設(shè)備治療，冷凍治療時間和治療結(jié)果見表2[37]。體內(nèi)腫瘤冷凍治療主要是采用氬氦刀和康博刀。我國自1999年引進(jìn)氬氦刀以來，已有2萬多例腫瘤患者接受氬氦刀冷凍消融治療，有效率達(dá)90%以上[38]。冷凍手術(shù)的有效率較高，但并不是最優(yōu)的。有研究表明，氬氦刀聯(lián)合應(yīng)用化療藥物或多種免疫療法可明顯提高患者的生存率[39-40]。劉冰和張元昊[41]的研究表明，氬氦刀聯(lián)合自體細(xì)胞免疫療法治療腸癌肝轉(zhuǎn)移較單純冷凍治療和單純自體細(xì)胞免疫療法治療，肝轉(zhuǎn)移灶縮小更明顯。Liang等[42]研究表明，在治療復(fù)發(fā)性乳腺癌時，冷凍消融術(shù)、自然殺傷細(xì)胞療法和赫賽汀組合治療法聯(lián)用，較單獨(dú)冷凍消融術(shù)法或冷凍消融術(shù)與自然殺傷細(xì)胞組合療法，可更好地降低循環(huán)腫瘤細(xì)胞水平，減少癌胚抗原和糖類抗原15-3，顯著增強(qiáng)免疫功能。我國首創(chuàng)的康博刀已成功完成臨床試驗(yàn)，可廣泛用于臨床實(shí)體腫瘤的冷凍治療，2018年7月13日在北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院進(jìn)行了首例臨床應(yīng)用，目前還未與其他療法、藥物組合[43]。

5 小 結(jié)

冷凍治療適用范圍廣泛，具有很高的臨床應(yīng)用價值。目前，對冷凍治療的冷卻速率、冷凍治療機(jī)制和適應(yīng)證治療效果的研究已經(jīng)比較充分，尤其是氬氦刀冷凍治療，而對于應(yīng)用時間較短的康博刀的臨床研究尚不充分?？挡┑秲r格低、運(yùn)營成本低、整體>AIDS：獲得性免疫缺陷綜合征工作性能優(yōu)于氬氦刀，更適合于我國臨床推廣應(yīng)用。確定氬氦刀或康博刀聯(lián)合多種免疫療法的治療方案、聯(lián)合應(yīng)用藥物類型和交付方式以及冷凍時間、復(fù)溫時間和凍融循環(huán)間的時間間隔，對提高臨床冷凍治療效果至關(guān)重要，但仍有待進(jìn)一步深入研究。此外，冷凍治療手術(shù)后，細(xì)胞破壞釋放組織抗原導(dǎo)致的免疫耐受也亟待解決。冷凍免疫應(yīng)答的深入研究，主要是細(xì)胞因子釋放和T細(xì)胞分化對基因?qū)用姹磉_(dá)的變化和相關(guān)信號通路的研究，對冷凍治療本質(zhì)的認(rèn)識具有重要意義。

表2 冷凍時間和癌變皮膚的冷凍治療結(jié)果