食用植物油中的色素檢測方法研究

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(濟南出入境檢驗檢疫局，山東 濟南 250014)

食品添加劑被譽為現(xiàn)代食品工業(yè)的靈魂，可改善食品的色、香、味和口感，增加營養(yǎng)價值，延長保質(zhì)期，改善食品加工工藝。食品添加劑添加量一般不超過2%，但涉及的食品范圍寬，影響作用大。據(jù)統(tǒng)計，目前世界上食品添加劑使用的品種在5 000種以上，我國使用的食品添加劑已達22個門類近1500個品種。其中依據(jù)GB2760-2014，植物油中允許添加的著色劑方面有3種，分別是沙棘黃、玉米黃、胭脂樹橙等，但是其相應(yīng)的檢測方法還不甚成熟，而且胭脂樹橙、沙棘黃、玉米黃色素均為混合色素，主色素的確定及含量、輔成分的使用宜忌還沒有文獻明確說明，這也是本文的工作重點。

玉米黃質(zhì)(Zeaxanthin,3，3'-二羥基-β-胡蘿卜素，簡寫為YMHZ)，亦稱玉米黃素，分子式C40H56O2，相對分子質(zhì)量為566.88，屬于異戊二烯類，是一種含氧的類胡蘿卜素[1]，與葉黃素屬同分異構(gòu)體，廣泛存在于綠色葉類蔬菜、花卉、水果、枸杞和黃玉米中[2]。

胭脂樹橙主要色素成分為紅木素(Bixin)和降紅木素(Norbixin)[3-4]，橙紫色晶體，熔點217℃(分解)，不易氧化，分子式：紅木素C25H30O4、降紅木素C25H28O4；相對分子質(zhì)量：紅木素394.51；降紅木素380.4。水溶性胭脂樹橙為紅至褐色液體、塊狀物、粉末或糊狀物，略有異臭，主要色素成分為紅木素水解產(chǎn)物降紅木素的鈉或鉀鹽，染色性非常好，耐日光性差。

1 材料與方法

1.1 試劑材料與儀器設(shè)備

乙腈，色譜純，默克化工技術(shù)有限公司；冰乙酸，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水，Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備。Agilent1260 series 液相色譜儀：配有FLD檢測器，美國安捷倫公司；分析天平( 感量為0.1 mg ) ：梅特勒-托利多公司；Milli-Q 純水器：美國Millipore 公司； IKA-KS130型振蕩器，德國IK公司；色譜柱：Waters XTerra RP-C18(4.6×250 mm，5μm)。

1.2 液相色譜分離條件

流動相：A,乙腈；B，H2O(含體積分?jǐn)?shù)0.5% 冰乙酸)；梯度洗脫：A-75(5 min)、A-75～95(1 min)、A-95(9 min)；流速：1 mL/ min；柱溫：40℃；吸收波長：460 nm；進樣體積：10μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

Bixin標(biāo)準(zhǔn)溶液: 稱取Bixin粉劑14.5 mg 置10 mL容量瓶中，加乙腈適量使溶解，未完全溶解部分加入甲醇-冰乙酸(9+1，v/v)約3 mL使之完全溶解，再加乙腈稀釋至刻度，搖勻，濃度為14500μg/mL。YMHZ的標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取YMHZ粉劑12.5 mg 置10 mL容量瓶中，加乙腈適量使溶解，再加入3 mL丙酮使之完全溶解，再加乙腈稀釋至刻度，搖勻，濃度為12500μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線: 精確移取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。制成質(zhì)量濃度為0、3、6、15、30、60μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。在設(shè)定色譜條件下，分別取10μL進行HPLC分析。以標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

1.4 油脂前處理及測定

精密稱取樣品約2.000g，加入10 mL正己烷飽和乙腈溶解，40℃超聲25 min，離心，取上清液過0.45μm濾膜后上機檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性

圖1 兩種色素標(biāo)準(zhǔn)樣品的液相色譜圖

Bixin和YMHZ對照品的色譜圖如圖1，Bixin線性方程為y=14.07894x+ 0.02007，相關(guān)系數(shù)r=0.99959；YMHZ線性方程為y=36.98284x-0.88955，相關(guān)系數(shù)r=0.99947。線性范圍均為3～60μg/mL；最低檢出限Bixin為1.0 mg/kg，YMHZ為0.10 mg/kg。

2.2 液相色譜條件的選擇

用于分析玉米黃素的HPLC系統(tǒng)主要可以分為正相與反相，而反相系統(tǒng)又有反相等度洗脫溶劑系統(tǒng)和反相梯度洗脫溶劑系統(tǒng)兩類。采用以硅膠為固定相的正相色譜法很難將玉米黃素與其它類胡蘿卜素分離開來，且對于玉米黃素的多種構(gòu)型更是難以區(qū)分，因此正相色譜法目前已被反相色譜所取代。反相溶劑系統(tǒng)的色譜柱常常使用結(jié)合有十八炭或三十炭硅烷的氧化硅作為分離柱，因此結(jié)合實驗室自身的條件，選擇了Waters XTerra RP-C18(4.6×250mm，5μm)色譜柱。

在Bixin和YMHZ的分離分析過程中，影響因素很多，除色譜柱之外，流動相及流動梯度是關(guān)鍵。結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，初步選擇乙腈、甲醇作為流動相中的有機相，水、乙酸水溶液作為流動相中的水相。本文比較了1%乙酸水溶液+甲醇、水溶液+甲醇、0.5%乙酸水溶液+甲醇、2%乙酸水溶液+甲醇、1%乙酸水溶液+乙腈、水+乙腈、0.5%乙酸水溶液+乙腈、2%乙酸水溶液+乙腈這幾種流動相，綜合對比分析峰型、響應(yīng)強度、色譜柱等因素，選擇0.5%乙酸水溶液+乙腈作為分析檢測Bixin、YMHZ的流動相(75+25)，流速為1.0 mL/min。為了調(diào)整兩種化合物的保留時間，尤其是YMHZ的保留時間，所以在流動相(75+25)的基礎(chǔ)上調(diào)整了梯度，以減少分析時間；圖2為兩種化合物的光譜圖，不難看出λ=460nm的時吸收強度最強，因此選擇460 nm作為檢測波長。圖3為兩種化合物的色譜圖，由此可知，各形態(tài)完全基線分離，峰型對稱、尖銳，滿足檢測需要。

圖2 色素標(biāo)準(zhǔn)樣品的液相光譜圖

圖3 樣品及加標(biāo)回收色譜圖

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

依據(jù)文獻及化合物本身的結(jié)構(gòu)性質(zhì)分析，Bixin和YMHZ的提取方式很多，本著簡單便捷、減少交叉污染的原則，選擇了超聲提取方式，提取液則選擇了與流動相較為一致的試劑。實驗表明，乙腈+乙酸(9+1，v/v)提取油脂中Bixin和YMHZ時，Bixin提取效率最高，但是YMHZ基本無回收；減少了提取溶劑中的乙酸百分比，略有回收，直至全部用乙腈(飽和了正己烷)提取時，兩個色素化合物的回收率均高于90%以上。超聲萃取具有耗時短、樣品無交叉污染的特點，適合大批量樣品的測定。經(jīng)加標(biāo)回收實驗，超聲萃取25 min，回收率均在95%以上，滿足檢測需要。

2.4 酸度對YMHZ的影響

在樣品前處理條件優(yōu)化過程中，偶然發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境不利于YMHZ的提取或檢測。為了更好的研究酸度對YMHZ的影響，實驗室做了一些工作：配置一系列相同濃度的YMHZ標(biāo)準(zhǔn)溶液，含乙酸的體積分?jǐn)?shù)分別為0、1%、2%、5%、10%、15%、20%、30%，液相譜圖見圖4，其中右圖為左圖的部分放大。從圖片可以看出，YMHZ(純度為90%)標(biāo)品中至少包含7種化合物，6號化合物為本文的目標(biāo)成分，也是含量最高的成分。在乙酸體積分?jǐn)?shù)為0～1%時，譜圖中各組分的峰強度并沒有明顯變化，僅在主峰的右側(cè)出現(xiàn)了一個較小的吸收峰7；隨著乙酸體積分?jǐn)?shù)增加，7號化合物的吸收峰逐漸增加，至乙酸體積分?jǐn)?shù)為5%時最強；同時，在乙酸體積分?jǐn)?shù)在0～5%之間時，1、2、3、4、5號吸收峰的強度變化不大。這說明，適量酸度的增強并未對1、2、3、4、5號化合物的結(jié)構(gòu)造成影響，僅僅使得YMHZ的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，改變后的結(jié)構(gòu)極性略微減弱。當(dāng)乙酸的體積分?jǐn)?shù)大于10%時，各個吸收峰的強度都在減弱；尤其是當(dāng)乙酸的體積分?jǐn)?shù)大于15%時，1、3、4、5吸收峰消失，2號吸收峰強度基本不變，6和7號化合物減弱到一定程度后也基本保持不變，這說明幾種化合物之間的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化已經(jīng)達到了某個平衡后基本不受酸度影響。

圖4 YMHZ標(biāo)準(zhǔn)樣品受乙酸影響的液相色譜圖

對比分析1～7號化合物吸收峰的光譜圖時發(fā)現(xiàn)，除化合物1外，2～6號化合物均在400～640nm之間有吸收。2號化合物的最大吸收波長約為466 nm與4號化合物的最大吸收波長相近，且在250～640nm之間吸收光譜圖形狀相近，有可能含有相同或相似的生色基團，不同之處僅在于吸收強度不同而已；而3號化合物與4號化合物的吸收光譜總體相似，但是3號化合物在450 nm有一個相對更強吸收，說明與4號化合物相比，3號化合物至少多包含1個生色基團；5～7號化合物均在400～500 nm間均有吸收，且峰型相似，據(jù)報道玉米黃質(zhì)屬于異戊二烯類， 常常與隱黃素、β-胡蘿卜素、葉黃素等共存，組成類胡蘿卜素混合物，這說明5號化合物可能時玉米黃質(zhì)的伴生物，都含有類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)； 6號化合物吸收光譜中b、c、d和7號化合物光譜圖中的f、g、h波長基本一致(圖5)，區(qū)別僅在于e吸收峰與a吸收峰相比有明顯的藍(lán)移，而且總體而言，7化合物的吸收峰強度要比6化合物的弱約100倍。這是因為YMHZ是一個大的共軛體，吸收強度較大，但是在酸性條件下，-OH逐漸質(zhì)子化，分子結(jié)構(gòu)逐步扭曲，共軛結(jié)構(gòu)被破壞，而導(dǎo)致分子吸收強度逐漸減弱，甚至沒有吸收。

圖5 6和7號化合物的吸收光譜

2.5 Bixin的穩(wěn)定性

Bixin對照品儲存液存儲與棕色試劑瓶中，使用溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配，最好也是在棕色試劑瓶中，因為，即使在棕色試劑瓶中，Bixin受光照影響也容易發(fā)生降解，色譜圖見圖6，從圖上可以看出，Bixin對照品的色譜吸收峰前出現(xiàn)了新吸收峰，保留時間非常接近，這說明與Bixin結(jié)構(gòu)比較相似。對比分析Bixin和Norbixin的分子結(jié)構(gòu)，不難發(fā)現(xiàn)，差別僅在于羧基和酯基，因此，在本實驗過程中Bixin的降解產(chǎn)物為Norbixin?？傊珺ixin在存儲使用過程中需謹(jǐn)慎，實驗過程中使用的溶液最好是現(xiàn)用現(xiàn)配。光照條件下，Bixin結(jié)構(gòu)中的酯基會發(fā)生分解，生成雙酸結(jié)構(gòu)，極性略增強，保留時間比Bixin略短。

圖6 Bixin對照品在光照30min后的液相色譜圖

3 小結(jié)

胭脂樹橙和玉米黃是GB 2760允許添加的著色劑，限量分別為20、5000 mg/kg。天然的提取的Bixin和YMHZ不但具有良好的生物安全性[2,5]，在抑制腫瘤方面還具有明顯作用，是不可多得的天然添加劑，但是從GB2760限量也可以看出，這兩種化合物的添加也不是無限制的，首先是因為添加添加劑在提取是很難純化，其次是因為在使用過程中穩(wěn)定性相對較差。在本文研究過程中發(fā)現(xiàn)：(1)建立食用植物油中Bixin和YMHZ的檢測方法，加標(biāo)回收良好；(2)在酸性條件下，YMHA極不穩(wěn)定，雖然很多研究表明YMHZ是生物安全系數(shù)很高的添加劑，但是其在酸性條件下，結(jié)構(gòu)變化僅限于推測，其生物安全性還有待研究；(3)在研究過程中還發(fā)現(xiàn)，即使是Bixin的標(biāo)準(zhǔn)品溶液在20℃光照放置一段時間發(fā)生了不同程度的降解，因此在使用過程中需謹(jǐn)慎。