E515-A對豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗的佐劑作用

麻勇棋，徐 偉，王越珉，胡松華

(浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus， PEDV)感染引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病[1]。PEDV可感染各年齡的豬，導(dǎo)致動物出現(xiàn)嘔吐、水樣腹瀉及脫水等臨床癥狀，以仔豬的感染最為嚴(yán)重，病死率可達(dá)80%～100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。疫苗注射是預(yù)防PEDV感染的常用方法之一。目前，已有PEDV的滅活疫苗、減毒活疫苗和基因工程疫苗等[2]。但在養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見動物注射疫苗后不能產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，其原因之一是疫苗的免疫原性不高[3-4]。因此，研究如何提高PEDV疫苗的免疫效果在生產(chǎn)上具有重要意義。為提高疫苗免疫效果，常將含疫苗抗原的水相和油相佐劑混合制成油乳劑疫苗。最近研究發(fā)現(xiàn)，將人參莖葉皂苷和油乳劑疫苗混合可提高疫苗的免疫效果。例如，包省軍等[5]報道，在以白油為佐劑的口蹄疫油乳劑疫苗中加入人參莖葉皂苷可顯著提高動物對疫苗的免疫應(yīng)答水平；李禹濤等[6]報道在以白油為佐劑的雞新城疫油乳劑疫苗中加入人參莖葉皂苷可顯著提高疫苗的免疫效果。但以白油為油相，和水相混合時通常要在高剪切力作用下才能形成穩(wěn)定的乳劑。例如，實(shí)驗(yàn)室條件下制備油乳劑時，乳化機(jī)的剪切轉(zhuǎn)速高達(dá)10 000 r·min-1時，才能形成穩(wěn)定的乳劑，制備工藝要求相對較高[7]。E515-A是一種主要含人參莖葉皂苷(GSLS)的白油佐劑，該佐劑和水相混合時在低剪切力(剪切轉(zhuǎn)速僅需200 r·min-1)作用下就可形成穩(wěn)定的乳劑，疫苗制備工藝要求相對較低。本研究探討E515-A對PEDV疫苗的免疫佐劑作用，為進(jìn)一步采用E515-A作為病毒性疫苗佐劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

含20%氫氧化鋁膠的0.9% NaCl溶液購自齊魯動物保健品有限公司；10號白油購自中國石化集團(tuán)杭州煉油廠；GSLS(含Re 16.36%、Rd 9.0%、Rg1 6.0%、Rb2 3.8%、Rc 3.7%、Rb1 2.4%和Rf 0.1%)購自吉林省宏久生物科技股份有限公司；E515-A(主要成分為含GSLS的白油)由本實(shí)驗(yàn)室研制；K562靶細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；PEDV(106.75TCID50mL-1)抗原及其抗體檢測試劑均由浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院李肖梁研究員惠贈。

1.2 PEDV疫苗的制備

將稀釋5倍后的PEDV抗原與鋁膠佐劑、E515-A佐劑或生理鹽水等體積混合，即每mL PEDV疫苗中抗原量相當(dāng)于105.75TCID50。制備油乳劑疫苗時，在油相(白油或E515-A)中緩慢加入等體積含PEDV抗原的水相，置31 ℃恒溫?fù)u床，于200 r·min-1混合乳化15 min。

1.3 含E515-A的PEDV疫苗的性狀檢驗(yàn)

采用染色法進(jìn)行油乳劑疫苗的類型鑒定，即分別用水溶性染料曙紅-Y和脂溶性染料蘇丹Ⅲ進(jìn)行染色，觀察內(nèi)外相染色情況；采用離心法進(jìn)行油乳劑疫苗的穩(wěn)定性檢測，即吸取10 mL油乳劑疫苗于離心管中，3 000 r·min-1離心15 min，觀察其析出與分層情況；采用NDJ-8S型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)和Nano ZS型納米粒度電位分析儀分別檢測油乳劑疫苗的黏度和粒徑大小及分布情況。

1.4 動物分組和處理

雄性ICR小鼠，6～8周齡，18～20 g，購自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。將72只小鼠隨機(jī)分成6組，每組12只，腹部皮下分別注射0.2 mL 0.9% NaCl溶液、PEDV抗原+0.9% NaCl溶液、PEDV抗原+GSLS溶液、PEDV抗原+白油、PEDV抗原+E515-A和PEDV抗原+氫氧化鋁膠，免疫2次，間隔2周，以0.9% NaCl溶液為陰性對照，氫氧化鋁膠為陽性對照。每組隨機(jī)取6只小鼠于一免后24 h采血分離血清用于檢測IFN-γ水平，并無菌分離脾臟制備淋巴細(xì)胞，用于檢測NK細(xì)胞殺傷活性。每組的另外6只小鼠于二免后的2周和3周采血分離血清，用于檢測PEDV特異性IgG抗體及其亞類IgG1和IgG2a水平及細(xì)胞因子IL-5的含量，并于二免后3周無菌分離脾臟制備淋巴細(xì)胞進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。

1.5 NK細(xì)胞殺傷活性試驗(yàn)

無菌分離脾臟，于研缽中磨碎后過200目濾網(wǎng)，濾液于1 500 r·min-1離心8 min，棄上清后，加入紅細(xì)胞裂解液于冰上處理3 min，然后于1 500 r·min-1離心8 min，棄上清，用Hank’s溶液洗滌3次，加入配好的細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液)，調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度至1 × 108和5 × 107mL-1，作為效應(yīng)細(xì)胞備用。調(diào)整K562細(xì)胞濃度至2 × 106mL-1作為靶細(xì)胞。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入100 μL兩種不同濃度的效應(yīng)細(xì)胞和100 μL靶細(xì)胞(效靶比分別為50∶1和25∶1)，效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞對照孔分別補(bǔ)充加入100 μL 1640培養(yǎng)液，置于CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱，37℃ 培養(yǎng)5 h，然后加入2 μg·μL-1的MTT溶液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后于1 500 r·min-1離心10 min，棄上清，加入150 μL的DMSO，避光振蕩15 min，測量D570值，并計(jì)算NK細(xì)胞殺傷活性。

NK細(xì)胞殺傷活性=[1-(效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞孔D570值-效應(yīng)細(xì)胞孔D570值)/靶細(xì)胞孔D570值]× 100%。

1.6 脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

脾淋巴細(xì)胞的制備同1.5節(jié)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 × 106mL-1。在96孔培養(yǎng)板中分別加入100 μL淋巴細(xì)胞，然后分別加入100 μL 1640培養(yǎng)液、5 μg·mL-1的刀豆蛋白(Con A)或4 μg·mL-1的脂多糖(LPS)，置于CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱，于37℃ 培養(yǎng)44 h，采用MTT法檢測D570值，并計(jì)算淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)。

SI=(刺激孔D值-空白孔D值)/(未刺激孔D值-空白孔D值)。

1.7 血清IgG抗體及其亞類檢測

采用間接ELISA方法檢測，在預(yù)包被PEDV抗原的96孔板中，加入100 μL 1∶1 600稀釋的待測血清，于37 ℃ 孵育60 min，洗板后加入100 μL HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶40 000稀釋)、IgG1(1∶1 500稀釋)或IgG2a(1∶1 500稀釋)抗體，于37 ℃ 孵育30 min，洗板后加入100 μL TMB顯色液，顯色時間為10 min，然后加入50 μL終止液后檢測D450值。

1.8 血清細(xì)胞因子測定

采用武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒檢測小鼠血清IFN-γ水平，具體操作按說明書進(jìn)行。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差，采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件中One-way ANOVA post-hoc多重比較的Duncan法進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 含E515-A的PEDV油乳劑疫苗的一般特征

含E515-A的PEDV油乳劑疫苗外觀呈乳白色。用水溶性染料曙紅Y染色時，表現(xiàn)為外相被染色，用脂溶性染料蘇丹紅Ⅲ染色時，表現(xiàn)為內(nèi)相被染色；3 000 r·min-1離心15 min后不分層；黏度為(18 ± 2) cP；粒徑分布在106～122 nm(92%)和6～8 nm(8%)，平均粒徑為106.9 nm(圖1)。

2.2 E515-A提高了小鼠早期免疫水平

各組小鼠在免疫后24 h檢測NK細(xì)胞殺傷活性。疫苗中添加佐劑的小鼠NK細(xì)胞殺傷活性顯著高于對照組(P<0.05)，以E515-A佐劑組的殺傷活性最高(P<0.05)。按照NK細(xì)胞殺傷活性大小，各組的排列次序依次為：E515-A組>白油組和鋁膠組>GSLS組>對照組(圖2-A)。疫苗中添加佐劑對小鼠血清IFN-γ的產(chǎn)生也有促進(jìn)作用，其中E515-A組的IFN-γ水平顯著高于其他各組(P<0.05)(圖2-B)。按照血清中檢出IFN-γ的水平高低，各組的排序?yàn)椋篍515-A組>白油組>鋁膠組>GSLS組和對照組。

圖1 含E515-A的PEDV油乳劑疫苗的粒徑分布Fig.1 Diameter distribution of PEDV oil emulsion vaccine containing E515-A

A，NK細(xì)胞殺傷活性；B，小鼠血清IFN-γ水平。柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。A， NK cytotoxicity; B， Serum IFN-γ level. Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.圖2 E515-A對機(jī)體早期免疫的影響Fig.2 Effects of E515-A on the early immune response

2.3 E515-A提高了血清特異性抗體水平

各組的血清特異性抗體水平見圖3。GSLS單獨(dú)使用不能提高IgG水平(P>0.05)；白油和鋁膠能夠顯著促進(jìn)IgG的產(chǎn)生(P<0.05)；當(dāng)GSLS和白油聯(lián)合使用(即E515-A佐劑)時對IgG的促進(jìn)作用優(yōu)于兩者單獨(dú)使用(P<0.05)。佐劑作用從大到小依次為E515-A>白油>鋁膠>GSLS(圖3-A)。如圖3-B所示，抗體亞類的結(jié)果與之相似，但鋁膠佐劑偏向于促進(jìn)IgG1水平(P<0.05)，而對IgG2a水平無顯著促進(jìn)作用(P>0.05)。

2.4 E515-A促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

如圖4所示，E515-A佐劑組小鼠的脾淋巴細(xì)胞在體外對Con A刺激的應(yīng)答能力顯著(P<0.05)高于其他組，對LPS刺激的應(yīng)答能力顯著(P<0.05)高于0.9% NaCl溶液、PEDV抗原+0.9% NaCl溶液及PEDV抗原+氫氧化鋁膠組。

A，IgG抗體水平；B，IgG亞類水平。A， IgG level; B， IgG subclasses level.圖3 E515-A對血清特異性抗體IgG及其亞類水平的影響Fig.3 Effects of E515-A on the serum specific IgG and its subclasses

圖4 E515-A對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of E515-A on spleen lymphocytes proliferation

3 討論

本研究表明，含人參皂甙的油佐劑E515-A可以和含PEDV抗原的水相在低剪切力下混合，形成穩(wěn)定的油乳劑PEDV疫苗。經(jīng)3 000 r·min-1離心15 min后乳劑不分層；黏度為(18±2)cP，符合獸藥典對注射用疫苗的要求。E515-A對PEDV疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有顯著的促進(jìn)作用，免疫促進(jìn)效果優(yōu)于鋁膠佐劑。和對照組比較，E515-A油佐劑可以顯著促進(jìn)免疫小鼠的NK細(xì)胞殺傷活性，促進(jìn)細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生，增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞對Con A和LPS刺激的增殖應(yīng)答能力，提高血清IgG及其亞類IgG1和IgG2a水平。

病毒侵入機(jī)體后首先刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答，激活NK細(xì)胞并促進(jìn)IFN-γ產(chǎn)生[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，含E515-A的PEDV疫苗免疫小鼠24 h后即可顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，促進(jìn)血清IFN-γ的生成，表明E515-A可以提高機(jī)體的早期免疫水平。PEDV疫苗誘導(dǎo)的體液免疫水平與機(jī)體抗病毒感染的能力密切相關(guān)[9]。E515-A可大幅度提高PEDV抗原誘導(dǎo)的IgG水平，提示該佐劑可通過提高體液免疫應(yīng)答增強(qiáng)機(jī)體的抗感染能力。淋巴細(xì)胞體外增殖反映了機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。Con A主要刺激T淋巴細(xì)胞增殖，LPS主要刺激B淋巴細(xì)胞增殖[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，含E515-A佐劑顯著增強(qiáng)了細(xì)胞對Con A和LPS刺激的反應(yīng)能力，表明E515-A可通過增強(qiáng)T和B淋巴細(xì)胞功能來提高細(xì)胞免疫應(yīng)答。不同的淋巴細(xì)胞可促進(jìn)不同類型的免疫反應(yīng)。Th1類淋巴細(xì)胞刺激IgG2a的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)；Th2類淋巴細(xì)胞刺激IgG1的產(chǎn)生，促進(jìn)體液免疫反應(yīng)[11]。本研究中E515-A可顯著提高IgG1和IgG2a水平，而鋁膠佐劑僅對IgG1有顯著促進(jìn)作用，對IgG2a無顯著促進(jìn)作用。這說明E515-A佐劑可促進(jìn)細(xì)胞免疫(Th1)和體液免疫(Th2)應(yīng)答，而鋁膠佐劑僅對Th2類免疫反應(yīng)有促進(jìn)作用，對Th1類免疫反應(yīng)幾乎無作用。這與Zhang等[12]和王萌等[13]報道的E515佐劑能顯著促進(jìn)金黃色葡萄球菌疫苗和口蹄疫疫苗誘導(dǎo)的Th1和Th2型免疫應(yīng)答的結(jié)果相似。

本研究用E515-A配制PEDV油乳劑疫苗，制備條件溫和，乳劑的穩(wěn)定性和黏度符合藥典要求，注射后局部吸收良好，未發(fā)現(xiàn)任何不良反應(yīng)。鑒于該佐劑對Th1和Th2型免疫具有顯著促進(jìn)作用，該佐劑用于PEDV疫苗的生產(chǎn)，可提高疫苗免疫效果，值得進(jìn)一步研究。