京海黃雞柔嫩艾美爾球蟲感染對脾臟和盲腸IL-6、IL-8、CCLi2基因表達量的影響及其相關性

辛世杰，王曉慧，戴國俊，*，安婷婷，張 濤，張跟喜，謝愷舟，王金玉，王宏勝

(1.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009； 2.江蘇省動物遺傳育種與分子設計重點實驗室，江蘇 揚州 225009； 3.江蘇京海禽業(yè)集團有限公司，江蘇 海門 226100)

據(jù)估計，全球每年因球蟲病造成的經(jīng)濟損失超過30億美元[1-2]，其中至少70%的經(jīng)濟損失是由球蟲病的亞臨床癥狀引起的群體生產(chǎn)性能降低所導致，這其中包括個體的生長阻滯和飼料轉(zhuǎn)化率的降低，24%是由于藥物預防和治療所增加的開支[3]。

林雨鑫[4]利用京海黃雞雞柔嫩艾美爾球蟲(Eimeriatenella)抗性和易感性不同的群體，進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)細胞因子-細胞因子受體互作通路中富集的差異基因有IL-6、IL-8、IL-12β、IL15、IL-17和TGFB2。其中白細胞介素6(IL-6)是一種多功能細胞因子，在許多炎癥急性期反應、自身免疫性疾病和造血作用機制中起著至關重要的作用，尤其是炎癥性腸病[5]。Neurath等[6]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6信號通過誘導Jak/STAT-3和Ras/Erk/C/EBP途徑在控制T淋巴細胞的分化和活化中起關鍵作用。白細胞介素8(IL-8)是雞機體內(nèi)重要的趨化因子，可通過與免疫細胞上的受體CXCR1結(jié)合，將免疫細胞趨化至患處活化后，參與免疫反應，實現(xiàn)免疫細胞的抵抗功能，并能促進創(chuàng)傷愈合，它與急、慢性炎癥性疾病和自身免疫病密切相關[7]。研究表明，IL-8和pcDNA3-lE疫苗同時免疫時可以顯著抑止球蟲的復制[8]，可作為佐劑在雞艾美耳球蟲DNA疫苗中應用。CC趨化因子配體2(chemokine C-C motif 2，CCL2)是趨化因子CC亞家族中的一員，也是炎癥反應的啟動子，可以與其受體CCR2結(jié)合，促使單核細胞遷移[9]。方強[10]研究發(fā)現(xiàn)，在腸炎沙門氏菌感染后2和4 h，雞體內(nèi)脾臟和盲腸扁桃體中IL-1p、IL-6、IL-8和CCLi2的mRNA表達量均有不同程度的升高。因此開展雞IL-6、IL-8和CCLi2基因的表達調(diào)控研究，對探究3個基因的表達與球蟲病之間的關系具有十分重要的意義。

本研究通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測京海黃雞Eimeriatenella球蟲感染組和非感染對照組脾臟和盲腸中前炎性細胞因子IL-6和趨化因子IL-8、CCLi-2的mRNA相對表達量，分析3個基因表達量在感染與非感染群體間的差異，以及3個基因表達量的相關性，以期為后續(xù)雞球蟲抗性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

試驗個體來自江蘇京海禽業(yè)集團有限公司，剛出殼的80只雛雞(Gallusgallus)隨機平均分為兩組，在未落地之前飼養(yǎng)于火焰消毒的無球蟲籠舍中，飼喂不含抗球蟲藥劑的飼料，自由飲水。30日齡時對感染組的40只雞每只灌飼2.5萬個柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊，對照組的40只雞灌飼等量的生理鹽水。

1.1.2 組織樣本采集

感染后第7天進行屠宰，采集感染組和對照組所有雞的脾臟和盲腸的組織樣置于凍存管中，現(xiàn)場立即液氮保存，后轉(zhuǎn)移至-70 ℃冰箱保存。

1.1.3 主要實驗試劑與耗材

PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premxi ExTaqⅡ、Trizol、Rnase-Free Water等試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司；DEPC、甲醛、異丙醇、氯仿、氫氧化鈉、乙酸鈉、EDTA、無水乙醇、無酶槍頭、無酶PCR管和凍存管等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；熒光定量PCR專用光學封板膜(高透明)、0.2 mL半裙邊96孔PCR板(透明)購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 雞組織總RNA的提取和檢測

用Trizol法提取雞組織的總RNA。用微量紫外可見分光光度計對提取的京海黃雞組織總RNA進行D值測定，凡RNA樣品D260/D280值在1.8～2.0說明RNA純度較高，可以進行下一步實驗，若低于1.8說明提取的RNA可能存在蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)的污染，然后將京海黃雞各組織總RNA提取效果通過甲醛變性凝膠電泳進行檢測，在紫外光下觀察RNA條帶情況。將合格樣品稀釋至100 ng·μL-1，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實時熒光定量PCR引物設計及合成

根據(jù)GenBank中已公布的雞的IL-6、IL-8和CCLi2基因序列，使用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計3個目的基因的qRT-PCR引物，內(nèi)參基因GAPDH和β-actin的引物參照方強[10]設計的引物。引物選擇跨內(nèi)含子設計，以避免DNA的污染，引物由上海生工公司合成，引物設計詳細信息見表1。

1.2.3 cDNA的合成

按照PrimeScript RT Master Mix(perfect Real Time)試劑盒說明書將提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系的配置在冰上進行，反應體系為40 μL，體系包括5×Prime Script RT Master Mix 8 μL，組織總RNA 2 000 ng，Rnase-Free Water補足至40 μL。反應的條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

表1熒光定量PCR引物

Table1Quantitative real-time PCR primers used in this study

目的基因Gene引物名稱Primer name引物序列Primer sequence(5'→3')產(chǎn)物長度Amplification size/bp登錄號GenBank accession No. IL-6FCAAGGTGACGGAGGAGGAC254AJ309540RTGGCGAGGAGGGATTTCTIL-8FGGCTTGCTAGGGGAAATGA136AJ009800RAGCTGACTCTGACTAGGAAACTGTCCLi2FGGCAGACTACTACGAGACCAACAG70L34553RACGGCCCTTCCTGGTGATGAPDHFGGTGGTGCTAAGCGTGTTAT264K01458RACCTCTGTCATCTCTCCACAβ-actinFACACGGTATTGTCACCAACT263L08165RTAACACCATCACCAGAGTCC

1.2.4 目的基因和內(nèi)參基因引物的PCR擴增檢測

反應體系為20 μL，包括：10×Buffer 2.0 μL、25 mmol·L-1Mg2+2.2 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.8 μL、上下游引物(10 mmol·L-1)各1 μL、DNA模板1 μL(100 ng)、5 U·μL-1Taq酶0.2 μL、ddH2O 11.8 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸35 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，最后4 ℃保存。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增片段。

1.2.5 實時熒光定量PCR

采用SYBR GreenⅠ染料法進行熒光定量分析。配置20 μL，具體反應體系為：SYBR Premxi ExTaqⅡ(Tli RNase H Plus)10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ染料0.4 μL，模板cDNA 2 μL，加滅菌蒸餾水6 μL補全至20 μL即可。

熒光定量PCR的反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)；之后采集多個信息點進行熔解曲線分析，程序為：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s，60 ℃，15 s。每個樣品做3個重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

熒光定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行處理分析。使用SPSS18.0軟件對目的基因在不同組織間的相對表達量進行相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 京海黃雞組織總RNA提取結(jié)果

將提取好的總RNA通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果顯示總RNA的28S和18S條帶明亮、清晰、銳利(圖1)，并且用微量紫外分光光度計對提取的RNA檢測顯示樣品D260/D280值在1.8～2.0說明RNA純度較高，可以進行下一步實驗。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis figure of total RNA

2.2 IL-6、IL-8和CCLi2基因在實驗組與對照組京海黃雞的脾臟和盲腸中的差異表達分析

由圖2-a、b、c可見，IL-6、IL-8和CCLi2基因在京海黃雞感染和對照組的脾臟和盲腸組織中均有表達。在脾臟組織中，感染組中IL-6、IL-8和CCLi2三個基因的相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05)，其中IL-6基因表達量在感染組與對照組間達到了差異極顯著(P<0.01)；在盲腸組織中，IL-6、IL-8和CCLi2基因表達量感染組均極顯著(P<0.01)高于對照組。

由圖2-d、e、f可見，除對照組IL-6基因在盲腸和脾臟組織中的表達量差異不顯著(P>0.05)外，其他基因無論在對照組還是感染組，相對表達量差異均達到了顯著或極顯著的水平(P<0.05或P<0.01)，而且盲腸中各基因的表達量均高于脾臟。

2.3 脾臟組織中IL-6、IL-8和CCLi2基因表達的關聯(lián)分析

由表2可以看出，在感染組脾臟組織中，IL-8基因的表達與IL-6基因存在極顯著的正相關(P<0.01)，CCLi2基因的表達與IL-6、IL-8基因存在極顯著的正相關(P<0.01)，因此這3個基因在感染組脾臟組織中都呈極顯著正相關(P<0.01)；在對照組脾臟組織中，IL-6基因與IL-8基因存在不顯著的正相關(P>0.05)，但是IL-8、IL-6基因與CCLi2基因存在極顯著的正相關(P<0.01)。

2.4 盲腸組織中IL-6、IL-8和CCLi2基因表達的關聯(lián)分析

由表3可以看出，在感染組盲腸組織中，IL-6基因的表達與IL-8、CCLi2基因呈極顯著的正相關(P<0.01)，IL-8基因的表達與CCLi2基因相關性不顯著(P>0.05)；在對照組盲腸組織中，IL-6基因與IL-8和CCLi2基因之間存在極顯著的正相關(P<0.01)，IL-8基因與CCLi2基因也存在極顯著的正相關(P<0.01)。

a、b、c，同一組織不同組別各基因相對表達量的比較；d、e、f，同一組別不同組織各基因相對表達量的比較。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。a,b,c, Comparison of the relative expression of genes in the same tissue of different groups; d,e,f, Comparison of the relative expression of genes in different tissues of the same group.* meant significant difference(P<0.05)， ** meant extremely significant difference(P<0.01).圖2 IL-6、IL-8、CCLi2基因在感染組與對照組京海黃雞的脾臟和盲腸中表達的差異比較Fig.2 Comparison of the expression of IL-6， IL-8， CCLi2 genes between spleen and caecum in infected group and control group of Jinghai Yellow Chicken

表2感染組和對照組脾臟中3個基因表達的相關性分析

Table2Correlation analysis of three genes expression in spleen of infected and control groups

基因GenesIL-6IL-8CCLi2IL-610.475**0.579**IL-80.26110.890**CCLi20.853**0.996**1

上三角數(shù)據(jù)為感染組基因表達相關系數(shù)，下三角數(shù)據(jù)為對照組基因表達相關系數(shù)；右上角標“*”表示相關性顯著(P<0.05)，“**”表示相關性極顯著(P<0.01)，無標注表示相關性不顯著(P>0.05)。下同。

The upper triangular data was the correlation coefficient of gene expression in infected group， and the lower triangular data was the correlation coefficient of gene expression in control group. * meant significant correlation(P<0.05)， ** meant extremely significant correlation(P<0.01)， no subscript meant no significant correlation(P>0.05). The same as below.

2.5 脾臟和盲腸組織中IL-6、IL-8和CCLi2基因表達的關聯(lián)分析

由表4可以看出，感染組盲腸IL-6基因與脾臟中IL-6、IL-8和CCLi2均存在不顯著的正相關(P>0.05)，盲腸IL-8基因與脾臟中IL-8和CCLi2也存在不顯著的正相關(P>0.05)，盲腸IL-8基因與脾臟IL-6基因存在不顯著的負相關(P>0.05)，盲腸CCLi2基因與脾臟中IL-6、IL-8和CCLi2均存在不顯著的負相關(P>0.05)；對照組脾臟中的IL-6、IL-8和CCLi2與盲腸中的IL-6、IL-8和CCLi2之間相關性均不顯著(P>0.05)，而且在對照組只有盲腸中CCLi2基因與脾臟中IL-8、CCLi2之間存在不顯著的正相關(P>0.05)，其他各基因之間均存在不顯著的負相關(P>0.05)。

表3感染組和對照組盲腸中3個基因表達的相關性分析

Table3Correlation analysis of three genes expression in caecum of infected and control groups

基因GenesIL-6IL-8CCLi2IL-610.639**0.469**IL-80.667**10.324CCLi20.498**0.765**1

表1感染組與對照組的脾臟和盲腸中3個基因表達的相關性分析結(jié)果

Table4Correlation analysis of three genes expression in spleen and caecum of the infected and control groups

盲腸Caecum感染組Infection group脾IL-6Spleen IL-6脾IL-8Spleen IL-8脾CCLi2Spleen CCLi2對照組Control group脾IL-6Spleen IL-6脾IL-8Spleen IL-8脾CCLi2SpleenCCLi2IL-60.0910.0620.297-0.284-0.146-0.113IL-8-0.0140.1690.203-0.380-0.101-0.067CCLi2-0.162-0.110-0.023-0.4420.1940.207

正值表示正相關；負值表示負相關。

“+” meant positive correlation; “-” meant negative correlation.

3 討論

雞沒有淋巴結(jié)，只有原始的淋巴組織，雞盲腸扁桃體、脾臟等對免疫應答的產(chǎn)生起支配作用，而且從4日齡起，雞脾臟中的T淋巴細胞開始具備增殖及免疫功能，30日齡時較為完善[11]。因而我們選擇30日齡后的雛雞口飼柔嫩艾美爾球蟲后耐過第7天的雞來檢測3個基因在脾臟和盲腸中的表達量，從而研究經(jīng)感染后耐過的雞體內(nèi)3個基因表達量與球蟲感染之間的關系。

劉偉杰等[12]在鴨源NDV激活雞先天性免疫應答的比較研究中發(fā)現(xiàn)，感染后雞的IL-6在12、24和48 h表達量分別為正常值的0.157倍、4.084倍和0.052倍，呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)再下調(diào)的趨勢。Fernando等[13]研究發(fā)現(xiàn)，感染巴西野外分離株禽傳染性支氣管炎病毒(IBV/Brazil/PR05)可導致雞的腎臟和氣管中IL-6表達量顯著升高，病變的發(fā)展狀況與組織中存在的IL-6有關。因此，趙娜等[14]認為，雞IL-6在替代抗生素，用作免疫增強劑和免疫佐劑等方面具有良好的發(fā)展前景。本實驗研究結(jié)果表明，雞柔嫩艾美爾球蟲感染京海黃雞后在盲腸誘發(fā)炎癥反應，提高了IL-6基因表達量，增強了雞球蟲病的抵抗力。Bannerman等[15]研究表明，由大腸埃希菌感染引起的乳房炎的奶中，IL-8含量顯著增加。張鑫宇等[16]對雞馬立克氏病病毒(CMDV)類白細胞介素8(vIL-8)基因進行了克隆和表達，發(fā)現(xiàn)vIL-8基因重組產(chǎn)物具有趨化雞外周血淋巴細胞的活性。Min等[17]報道了IL-8在雞艾美爾球蟲DNA疫苗中佐劑應用。本研究發(fā)現(xiàn)，京海黃雞IL-8基因在口服球蟲卵囊后組織中的表達量與對照組差異顯著，球蟲卵囊感染的京海黃雞的脾臟和盲腸組織中IL-8基因的表達量均升高，說明IL-8基因在雞的球蟲感染中發(fā)揮一定的作用。CCLi2是一類具有趨化能力的小分子蛋白，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移以及單核細胞的募集、誘導和分化方面發(fā)揮重要作用，并在一些免疫相關疾病中活化免疫細胞，參與免疫調(diào)節(jié)[18-19]，還會促進骨髓中髓樣細胞的活化[20-21]。本研究CCLi2基因在感染組脾臟和盲腸組織中的相對表達量較對照組均顯著升高，說明CCLi2基因在京海黃雞球蟲病中發(fā)揮重要作用。

Baron等[22]在研究中發(fā)現(xiàn)，IL-8和IL-6基因協(xié)同表達升高有助于疾病的良好進展以及對病原體的抵抗。Kogut等[23]在雞的沙門氏菌研究中發(fā)現(xiàn)，感染后雞的IL-6和IL-8的mRNA表達顯著上調(diào)，并且IL-6和IL-8的表達呈顯著的正相關。CCLi2能夠促進IL-4、IL-6等抗炎性細胞因子的大量分泌[24]，而在本實驗中感染組和對照組脾臟和盲腸組織內(nèi)CCLi2與IL-6基因也都存在極顯著的正相關。Swaggerty等[25]通過連續(xù)3個世代選擇外周血白細胞促炎性細胞因子白介素6(IL-6)、IL-8和趨化因子CCLi-2的高水平的肉雞個體(非球蟲感染)進行配種，發(fā)現(xiàn)3個基因的正向協(xié)同作用使其后代柔嫩艾美爾球蟲的抵抗能力極顯著地高于低水平選擇交配群體，而且Swaggerty等[26]還發(fā)現(xiàn)，對沙門氏菌抵抗力較強的1日齡雛雞體內(nèi)IL-6和IL-8基因的表達量均高于易感雞，且IL-6與IL-8基因的表達具有較強的正相關性。在本研究的感染組中，京海黃雞脾臟中IL-6、IL-8和CCLi2之間均存在極顯著的正相關，而在盲腸組織只有IL-6和IL-8、IL-6和CCLi2間存在極顯著正相關；在對照組的脾臟組織中只有IL-8、IL-6基因與CCLi2基因之間存在極顯著的正相關，而IL-6與IL-8基因之間相關不顯著，在盲腸組織中IL-6、IL-8和CCLi2之間也均存在極顯著的正相關。說明這3個基因?qū)η蛳x病的發(fā)展具有協(xié)同作用。