黃麻鏈霉菌AUH-1抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵優(yōu)化研究

楊 勇，張 勇，李書琴，章帥文，劉 群，李昆太

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黃麻鏈霉菌AUH-1抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵優(yōu)化研究

楊 勇，張 勇＊，李書琴，章帥文，劉 群，李昆太*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

黃麻鏈霉菌AUH-1具有廣譜拮抗作用，能產(chǎn)生對水稻紋枯病菌、西瓜枯萎病菌等多種植物病原真菌具有強(qiáng)烈抑制作用的活性物質(zhì)。采用響應(yīng)面法對黃麻鏈霉菌AUH-1培養(yǎng)基成分中的碳源、氮源進(jìn)行優(yōu)化，以期提高黃麻鏈霉菌AUH-1對水稻紋枯病菌的抑制效果。利用不同碳氮源進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定碳氮源水平，應(yīng)用Design-Expert 8.05b軟件中Box-Benhnken設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)，得到黃麻鏈霉菌AUH-1發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)配比組合濃度。結(jié)果表明，優(yōu)化后培養(yǎng)基的成分濃度為蔗糖3.1%、玉米淀粉0.25%、玉米漿4.5%、硫酸銨0.375%，在此濃度配比下黃麻鏈霉菌AUH-1對水稻紋枯病菌的抑制效果最佳，模型預(yù)測值為70.504 1%，實(shí)際優(yōu)化值達(dá)到69.31%，相比基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了5.78%。為進(jìn)一步研制水稻紋枯病生防制劑和殺菌劑奠定基礎(chǔ)。

黃麻鏈霉菌AUH-1；水稻紋枯病菌；響應(yīng)面法；培養(yǎng)基；抑制率

由立枯絲核菌（Kühn）引發(fā)的水稻紋枯病已經(jīng)成為全球性的病害[1]，是水稻4大真菌病害（紋枯病、稻瘟病、稻曲病和惡苗?。┲籟2]，該病在集約化種植系統(tǒng)中嚴(yán)重地阻礙了水稻的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)[3]。因此提高病蟲害防治的有效性[4]，顯示出越來越廣闊的應(yīng)用前景。鑒于此，篩選拮抗菌株，開發(fā)新型農(nóng)用抗生素對于水稻紋枯病的防治具有重要的指導(dǎo)意義。

迄今為止，從自然界中發(fā)現(xiàn)的上萬種天然抗生素中，約70%是由放線菌產(chǎn)生的。放線菌AUH-1是本課題組從江西農(nóng)業(yè)大學(xué)后山土壤中分離得到的一株放線菌。通過多項(xiàng)分類，確定菌株AUH-1隸屬于黃麻鏈霉菌（）[5]，該菌株的次級代謝產(chǎn)物能抑制包括在內(nèi)的多種植物病原真菌，如西瓜枯萎病菌（f. sp.）、辣椒疫病菌（）和煙草黑脛病菌（）等。因此，黃麻鏈霉菌AUH-1可以作為有潛在開發(fā)價值的抗生素產(chǎn)生菌。本文就其發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 黃麻鏈霉菌（）AUH-1菌株：由本實(shí)驗(yàn)室自行分離篩選獲得，甘油凍存管-20℃保存。

1.1.2 測試菌株 水稻紋枯病菌（）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 指示菌培養(yǎng)基：（1）PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。（2）高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2~7.4。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖40 g，玉米淀粉20 g，玉米漿20 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，MnSO40.01 g，ZnSO40.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2~7.4。

所有培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌30 min備用。

1.2 方 法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 菌種活化：將保存的AUH-1菌株接種于斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d。黃麻鏈霉菌AUH-1新鮮斜面用1 cm′2 cm規(guī)格的接種鏟挖菌塊，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量：100 mL/500 mL三角瓶），在28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)6 d，收集發(fā)酵液，加入2倍體積工業(yè)酒精浸提48 h，離心，取上清液經(jīng)減壓濃縮至酒精蒸干，濃縮液用0.22mm無菌微孔濾膜過濾，即為發(fā)酵粗提液，存于4 ℃冰箱，備用。

1.2.2 抗真菌活性物質(zhì)的生物測定 采用抑制菌絲生長速率法，將指示菌水稻紋枯病菌接種至PDA平板上，在28 ℃下培養(yǎng)7 d，用直徑為6 mm打孔器打取菌落邊緣菌塊作為接種物，接種至含有發(fā)酵粗提液的PDA平板上，以含等量無菌水的PDA平板為對照，培養(yǎng)48 h后采用十字交叉法測定菌落大小，按公式1算出菌絲生長抑制率。

1.2.3 菌體生長量的測定 以菌絲體干質(zhì)量來計算菌體的生長量，收集各組培養(yǎng)液50 mL至已稱質(zhì)量(W0)的50 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min后棄上清，將離心管連同菌絲一起置于80 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘至恒質(zhì)量(W1)，根據(jù)公式2計算每升發(fā)酵液中的菌絲體干質(zhì)量(W)。各處理做3次重復(fù)。

=(1-0)×20 （2）

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 首先采用單因子試驗(yàn)，對碳源、氮源成分以及濃度進(jìn)行優(yōu)化，然后在單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用Box-Benhnken原理設(shè)計3個水平、4個因素的響應(yīng)面分析，并探究各因素及濃度對響應(yīng)值抑制率影響的顯著性以及最好的培養(yǎng)基組合[6]。

1.2.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Microsoft excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，origin 9.0和DPS 7.05進(jìn)行作圖和差異顯著性分析，Box-Benhnken Design試驗(yàn)結(jié)果的方差分析采用Design-Expert 8.05b進(jìn)行因子分析和響應(yīng)面分析（≤0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃麻鏈霉菌AUH-1培養(yǎng)條件的確定

2.1.1 培養(yǎng)基最適碳、氮源的確定 在該實(shí)驗(yàn)供試的5種碳源及5種有機(jī)和無機(jī)氮源中，黃麻鏈霉菌AUH-1利用蔗糖為碳源、玉米漿為有機(jī)氮源和硫酸銨為無機(jī)氮源時，最有利于菌絲體和抗菌活性物質(zhì)的生成。由圖1A可知，不同的碳源處理對于黃麻鏈霉菌AUH-1抗菌活性物質(zhì)和菌體量有明顯的影響；幾種碳源對AUH-1產(chǎn)生的活性物質(zhì)對紋枯病菌的抑制效果從高到低依次為蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖和乳糖，當(dāng)蔗糖為碳源時，菌體產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)含量達(dá)到最大值，且與葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖和乳糖差異顯著。雖然麥芽糖作為發(fā)酵碳源較其它的碳源可獲得更高的生物量，但該條件下抗菌活性物質(zhì)明顯低于蔗糖作為碳源時所產(chǎn)活性物質(zhì)，且麥芽糖成本明顯高于蔗糖，因此選擇蔗糖作為碳源。

對黃麻鏈霉菌AUH-1生長量及其產(chǎn)活性物質(zhì)的影響來說，不同有機(jī)、無機(jī)氮源的培養(yǎng)基產(chǎn)抗菌物質(zhì)含量由大到小依次為玉米漿、蛋白胨、黃豆餅粉、牛肉膏和酵母膏，硫酸銨、硝酸銨、磷酸氫二銨、氯化銨和硝酸鈉。當(dāng)有機(jī)氮源為玉米漿，無機(jī)氮源為硫酸銨時，與其他有機(jī)氮源差異顯著，且該條件下的菌體量也達(dá)到最大值。酵母膏、硝酸鈉和氯化銨等產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)較少。因此，選用蔗糖，玉米漿和硫酸銨作為碳、氮源作進(jìn)一步試驗(yàn)。

圖1 碳、氮源種類對R. solani抑制率及S. corchorusii AUH-1生長量的影響

2.1.2 培養(yǎng)基最適碳、氮源濃度的確定 由圖2可以看出，蔗糖、玉米淀粉、玉米漿和硫酸銨等營養(yǎng)成分的添加量對抑制率及AUH-1菌株生長量的影響較為明顯。當(dāng)蔗糖、玉米淀粉、玉米漿和硫酸銨濃度分別為4.0%、0.5%、3.0%和0.25%時，AUH-1菌株所產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的含量均高于碳、氮源的其他濃度，且該系列濃度下的菌體生長量仍保持著較高水平，既滿足了菌體生長，又得到了所需的抗菌活性物質(zhì)。因此，選用該系列碳、氮源濃度作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

圖2 碳、氮源濃度對R. solani抑制率及S. corchorusii AUH-1生長量的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基的組成

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定的蔗糖、玉米淀粉、玉米漿及(NH4)2SO4等因素的水平范圍，用Design-Expert 8.05b軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)，進(jìn)行了4因素3水平的29組實(shí)驗(yàn)。因素水平表見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與方差分析 培養(yǎng)基組分優(yōu)化的目的不僅是為了提高菌體量，更重要的是為了得到能夠高產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的培養(yǎng)基配方。以為指示菌，以黃麻鏈霉菌AUH-1發(fā)酵液的抑制率（）為響應(yīng)面，利用Design-Expert 8.05b軟件對其進(jìn)行回歸擬合，以A、B、C、D為自變量對抑制率進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合建立如下多元二次回歸數(shù)學(xué)模型：

=0.42′-0.52′-0.72′+0.62′+0.43′′-0.45′′-0.18′′-0.13′′-0.65′′+0.60′′- 0.76′2-0.70′2+0.81′2+0.20′2，

其中為抑制率，A、B、C、D分別為蔗糖、玉米淀粉、玉米漿、(NH4)2SO4。對回歸模型進(jìn)行可信度分析和方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，模型=3.91，-value=0.007 8<0.01，表明回歸方程極顯著。失擬項(xiàng)為0.210 8，大于0.05，說明該模型失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型的模擬性比較良好，建立的回歸方程能運(yùn)用于AUH-1菌株產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的理論預(yù)測。由表3可以得出，因素A、C對AUH-1菌株產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的影響效應(yīng)均不顯著；因素B、D對AUH-1菌株產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的影響效應(yīng)顯著；因素B、C之間對AUH-1菌株產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的交互影響極顯著，其他因素之間的交互影響效應(yīng)不顯著；因素A2、B2、C2對AUH-1菌株產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的影響效應(yīng)顯著，而D2對其影響效應(yīng)不顯著。

表3 回歸方差分析

*表示<0.05，差異顯著；**表示<0.01，差異極顯著。

利用Design-Expert 8.05b軟件根據(jù)多元二次回歸方程繪制了相應(yīng)的三維響應(yīng)曲面圖，如圖3所示。用圖3對黃麻鏈霉菌AUH-1產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的影響的任何兩種因素之間的交互效應(yīng)進(jìn)行分析，進(jìn)而確定最佳因素水平。從圖3可以看出，蔗糖和玉米淀粉間交互作用呈現(xiàn)典型的先升高后降低趨勢。

圖3 各因素交互作用對S.corchorusii AUH-1產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的影響

2.2.3 黃麻鏈霉菌AUH-1產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的培養(yǎng)基最適組合 回歸方程對AUH-1菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)相應(yīng)面試驗(yàn)擬合良好，因此，可用回歸方程對此試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析。通過軟件進(jìn)行分析預(yù)測，預(yù)測的抑制率為70.504 1%，此時蔗糖含量為3.1%、玉米淀粉含量為0.25%、玉米漿含量為4.5%、硫酸銨含量為0.375%。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行?，按照最佳配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，以相同的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，已基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，測得優(yōu)化培養(yǎng)基抑制率均值為69.31%，與理論預(yù)測值相比，其相對誤差為1.69%，在可接受范圍內(nèi)，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的65.52%，抑制率相比提高了5.78%，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié)論與討論

黃麻鏈霉菌AUH-1對水稻紋枯病菌有較強(qiáng)的抑制作用，但利用發(fā)酵液進(jìn)行生物防治在運(yùn)輸、儲存和成本等方面都存在著諸多的不便，因此從發(fā)酵液中提取分離和純化得到抗菌物質(zhì)顯得尤為的重要，而發(fā)酵培養(yǎng)基對活性物質(zhì)的代謝合成具有十分重要的影響[7]。因此本研究通過改良發(fā)酵培養(yǎng)基來獲得更高的活性物質(zhì)產(chǎn)量。在工業(yè)微生物的藥物發(fā)酵生產(chǎn)中，葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖等糖類物質(zhì)都是常用的速效碳源。而葡萄糖在所有碳源中是最易利用的，自然界中幾乎所有的微生物都能利用葡萄糖，因此葡萄糖常常用作培養(yǎng)基的一種主要營養(yǎng)成分[8]。從單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果可以看出，黃麻鏈霉菌AUH-1在以速效碳源蔗糖為唯一碳源時，其菌體濃度及所產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)含量顯著高于長效碳源可溶性淀粉時的菌體濃度和活性物質(zhì)含量。根據(jù)文獻(xiàn)[9]報道，黃麻鏈霉菌NF0919在以可溶性淀粉和馬鈴薯淀粉為發(fā)酵碳源時，發(fā)酵代謝產(chǎn)生的過量葡萄糖會加速菌體的呼吸，使培養(yǎng)基中的溶解氧（DO）不能滿足菌體生長需要，從而使一些酸性中間代謝物，如乙酸、乳酸和丙酮酸等不能被完全氧化而積累在菌體和培養(yǎng)基中，導(dǎo)致發(fā)酵液pH降低，進(jìn)而抑制菌體生長和產(chǎn)物合成。此外，有機(jī)氮源和無機(jī)氮源也是構(gòu)成放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基重要的組成部分，微生物在含有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中常常會表現(xiàn)出生長旺盛，而且微生物在有機(jī)氮源培養(yǎng)基中，會直接利用氨基酸和其他有機(jī)氮化合物中的各種不同結(jié)構(gòu)式的碳架，合成生命所需的蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)，而無需從糖代謝的分解產(chǎn)物合成所需物質(zhì)[10]。

相比于一般的正交實(shí)驗(yàn)和單因子實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面分析法由于周期短、試驗(yàn)次數(shù)少，又能夠同時研究多個因素之間的交互作用，并且求得的回歸方程精確度較高，是優(yōu)化生產(chǎn)加工條件、降低生產(chǎn)成本、獲得更高質(zhì)量的產(chǎn)品、解決生產(chǎn)過程中實(shí)際問題的一種非常有效的統(tǒng)計學(xué)辦法[11]，目前已被廣泛運(yùn)用于生物領(lǐng)域[12-15]。本試驗(yàn)首先從單因素實(shí)驗(yàn)出發(fā)，利用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計和響應(yīng)面優(yōu)化分析確定蔗糖、玉米淀粉、玉米漿和硫酸銨的最佳因素水平分別為3.1%、0.25%、4.5%和0.375%。最后按照響應(yīng)面優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到實(shí)際抑制率為69.31%，與模型預(yù)測值的相對誤差為1.69%，并且，相對于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的65.52%，抑制率相比提高了5.78%。

筆者通過前期研究發(fā)現(xiàn)，黃麻鏈霉菌AUH-1的發(fā)酵產(chǎn)物對多種植物真菌病害的病原菌都具有拮抗作用，因此其具有成為抗生素產(chǎn)生菌的開發(fā)潛力。本試驗(yàn)得到該菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，為黃麻鏈霉菌AUH-1進(jìn)一步的工業(yè)開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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Study on Fermentation Optimization of Antifungal Active Substance ofAUH-1

YANG Yong, ZHANG Yong＊, LI Shu-qin, ZHANG Shuai-wen, LIU Qun, LI Kun-tai*

(School of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

AUH-1 had broad-spectrum in suppressing the growth of various fungal plant pathogens, such asandf.sp.. In order to improve the inhibitory effect ofAUH-1 on, the response surface methodology was used to optimize the carbon source and nitrogen source in the culture medium in this paper. A single factor experiment was designed and tested with different concentration of carbon source and nitrogen source. According to the test results, the carbon source and nitrogen source were selected as variables. Design-Expert 8.05b Software was used in the design of the test group of Box-Benhnken, the data were analyzed by using Design-Expert 8.05b software, and the optimal combination concentration of carbon source and nitrogen source was obtained. The results showed that the optimal component level of each factor was 3.1% sucrose, 0.25% corn starch, 4.5% corn steep liquor and 0.375% ammonia sulfate, and the inhibitory effect ofAUH-1 onwas the best under this concentration. The model prediction value was 70.5041% and the actual optimized value was 69.31%, which was 5.78% higher than that of the basic medium. This study laid a foundation for the further development of rice sheath blight bio-control agents and fungicides.

AUH-1;; response surface methodology; culture medium; inhibition rate

S467

A

2095-3704（2018）04-0268-07

2018-10-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（209005220）、江西?。ㄇ嗄辏┳匀豢茖W(xué)基金重大項(xiàng)目（20143ACB2100）和江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)計劃項(xiàng)目（20142BCB23025）

楊勇（1993—），男，碩士生，主要從事微生物資源利用方面的研究，wy931221@sina.com，＊為共同第一作者；

李昆太，教授，博士，atai78@sina.com。

10.3969/j.issn.2095-3704.2018.04.57

楊勇, 張勇, 李書琴, 等. 黃麻鏈霉菌AUH-1抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵優(yōu)化研究[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2018, 41(4): 268-274.