肝癌組織IFITM3蛋白表達(dá)水平及其與肝細(xì)胞癌患者手術(shù)切除術(shù)后肝內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)性分析*

代曉楠,呂金燕，翁文采,鄭麗麗

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國最為常見的一種惡性程度很高的惡性腫瘤[1]。調(diào)查顯示，大多數(shù)肝癌很容易發(fā)生肝內(nèi)或遠(yuǎn)處器官腫瘤轉(zhuǎn)移，即便是在能接受手術(shù)切除治療的早期患者，術(shù)后3 a復(fù)發(fā)率也超過50%[2，3]。因此，針對(duì)肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究一直是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。研究指出，腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)由多基因參與的過程，涉及多步驟和多環(huán)節(jié)，每個(gè)階段都會(huì)受到一個(gè)或多個(gè)基因/蛋白的調(diào)控，而干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白（interferon-induced transmembrane protein，IFITM3）基因家族成員就在其中發(fā)揮著重要的作用[4，5]。IFTIM3基因是IFITM家族中的一員，有研究證實(shí)該基因編碼的蛋白參與了結(jié)腸癌和乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但有關(guān)其在肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中的作用及具體機(jī)制尚未形成明確的認(rèn)知[6，7]。本研究采用Western blot法和免疫組化（SP）法檢測了肝癌組織IFITM3蛋白表達(dá)情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年4月～2016年2月在我院接受根治性手術(shù)切除治療的HCC患者43例，男性31例，女性12例；年齡43～76歲，平均年齡（55.63±3.92）歲。根據(jù)全國第四屆肝臟外科學(xué)會(huì)會(huì)議修訂的HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷，且經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查證實(shí)。其中伴隨肝內(nèi)衛(wèi)星轉(zhuǎn)移灶者29例，無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶者14例；低分化癌21例，中分化癌11例，中高分化癌11例。所有患者均為首次發(fā)病，手術(shù)前未接受過任何放化療。術(shù)中取肝癌組織和距離腫瘤2 cm以上的癌旁組織，置于液氮中保存。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 BX41型顯微鏡（OLYPMPUS，日本），YSP-300生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（Leica，德國），紫外可見分光光度計(jì)（Pharmacia Biotech，美國），免疫組化染色抗體孵育盒（中杉，中國），Western blot垂直電泳儀（Eppendorf，德國），熒光定量 PCR 分析儀 7500（ABI，美國），CO2恒溫培養(yǎng)箱（醫(yī)用設(shè)備有限公司，中國）。兔抗人 IFITM3蛋白多克隆抗體和鼠抗人 β-catin蛋白單克隆抗體（Proteintech，美國），酶標(biāo)羊抗鼠 IgG 聚合物、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG、DAB顯色試劑盒（中杉，中國），蘇木素（上?；瘜W(xué)試劑有限公司），Western Blot制膠盒和膠片（長城生物技術(shù)有限公司），PBS緩沖液（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），兩步法蛋白提取試劑盒（北京普利萊生物技術(shù)有限公司），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Western一抗稀釋液（江蘇碧云天）。

1.3 組織IFITM蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法，取剪碎后的癌組織和癌旁組織，加入RIPA裂解液，收集組織蛋白，采用BCA法檢測總蛋白濃度。將等量的總蛋白加入各孔中進(jìn)行垂直電泳，卸膠，轉(zhuǎn)膜，用三蒸水漂洗，在封閉液中搖床封閉2 h，以β-actin作為內(nèi)參照。三蒸水漂洗，加入一抗稀釋液，4℃下過夜，室溫下加TBST，搖床上清洗，10 min×3次；加TBST漂洗從一抗中取出的膜，10 min×3次，加入二抗稀釋液，室溫下孵育2 h，室溫下在搖床上TBST清洗，10 min×3次；采用HRP-ECL發(fā)光法顯影。對(duì)顯影的條帶進(jìn)行拍照，讀取IFITM和β-actin灰度值，計(jì)算兩者的灰度值比。另采用SP法檢測，取經(jīng)福爾馬林固定的癌組織和癌旁組織，石蠟包埋、切片，置于60℃烘箱中烤片過夜，室溫下將切片置于3%O2H2孵育20 min，PBS沖洗3次，每次間隔3 min。加入一抗50μl，37℃下孵育25 min，PBS沖洗3次，每次間隔3 min；加入二抗50μl，室溫下孵育25 min，PBS沖洗3次，每次間隔3 min；加入DAB顯色劑50μl顯色2 min，自來水沖洗，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染2 min，PBS返藍(lán)1 min，酒精脫水2 s，干燥后用中性樹膠封片。判斷IFITM3陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)：胞質(zhì)呈棕黃色顆粒狀為IFITM陽性染色細(xì)胞。在400倍顯微鏡下判斷免疫組化檢測結(jié)果，隨機(jī)選擇每張切片的5個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)算細(xì)胞陽性率和染色強(qiáng)度。由兩名病理科醫(yī)生采用雙盲法對(duì)每張切片進(jìn)行觀察閱片，取平均值。

1.4 隨訪 所有入選患者均接受根治性手術(shù)切除腫瘤，隨訪1年，術(shù)后每3個(gè)月檢測血清甲胎蛋白（AFP），行腹部B超檢查。當(dāng)發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)有可疑的占位性病灶時(shí)，則進(jìn)行腹部CT檢查，根據(jù)檢查結(jié)果確認(rèn)復(fù)發(fā)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 23.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s描述，采用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)，IFITM3蛋白表達(dá)陽性率的比較采用x2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織和癌旁組織IFITM3蛋白的表達(dá)情況 Western Blot法檢測結(jié)果顯示肝癌組織IFITM3表達(dá)水平為（1.2386±0.1901），顯著強(qiáng)于癌旁組織的（0.9496±0.0995），差異顯著（t=8.832，P=0.000）。此外，不同腫瘤大小、TNM分期、有無肝內(nèi)衛(wèi)星轉(zhuǎn)移灶腫瘤間IFITM3表達(dá)水平存在顯著性差異（P＜0.05），而在不同性別、年齡和血清AFP水平患者間比較無顯著性差異（P＞0.05，表1）。經(jīng)免疫組化法檢測肝癌組織和癌旁組織IFITM3表達(dá)，可見IFITM3陽性細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒狀，其中肝癌組織IFITM3蛋白表達(dá)陽性率為72.1%（31/43），顯著高于癌旁組織的 14.0%（6/43，x2=29.647，P=0.000）。此外，中分化肝癌組織IFITM3蛋白陽性率為90.9%（10/11），低分化肝癌組織為 95.2%（20/21），均明顯高于高分化組的9.1%（1/11，x2=14.727，P=0.000；x2=23.748，P=0.000）；伴肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組患者 IFITM3蛋白陽性率為93.1%（27/29），而不伴肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組為28.6%（4/14），兩者比較差異顯著（x2=19.544，P=0.000，圖1、圖2）。

表1 不同臨床和病理學(xué)特征患者肝癌組織IFTIM3表達(dá)水平（±s）比較

表1 不同臨床和病理學(xué)特征患者肝癌組織IFTIM3表達(dá)水平（±s）比較

例數(shù) IFITM3/β-actin t P性別 1.528 0.134男31 1.3199±0.1362女12 1.2394±0.1971年齡（歲） 0.695 0.491＞50 30 1.2651±0.1994≤50 13 1.2213±0.1639 AFP（μg/l） 1.424 0.162＞400 19 1.2014±0.1761≤400 24 1.2869±0.2094肝內(nèi)轉(zhuǎn)移 24.053 0.000有29 1.4936±0.0337無14 1.1093±0.0718 TNM分期 7.825 0.000Ⅰ/Ⅱ期 14 1.0996±0.0573Ⅲ/Ⅳ期 29 1.4002±0.1374腫瘤直徑（cm） 8.310 0.000≤5 17 1.1032±0.0617＞5 26 1.4025±0.1394

圖1 肝癌組織IFITM3蛋白表達(dá)情況（SP，400×）

圖2 癌旁組織IFITM3蛋白表達(dá)情況（SP，400×）

2.2 術(shù)后復(fù)發(fā)與無復(fù)發(fā)的HCC患者癌組織IFITM3蛋白表達(dá)情況比較 對(duì)43例患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，發(fā)現(xiàn)1年內(nèi)肝內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)患者21例（48.8%）；術(shù)后復(fù)發(fā)組癌組織IFITM3蛋白陽性率為81.0%（17/21），未復(fù)發(fā)組為22.7%（5/22），兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=14.578，P=0.000）。

3 討論

肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者生存時(shí)間，導(dǎo)致患者死亡的重要原因，但目前有關(guān)肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚不清楚，尤其是在分子調(diào)控層面[8]。研究指出，腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)從分子水平大致有原發(fā)腫瘤細(xì)胞生長增殖、癌細(xì)胞在黏附分子介導(dǎo)下與細(xì)胞外黏附、癌細(xì)胞釋放大量水解細(xì)胞外基膜和基質(zhì)的蛋白水解酶、組織被水解酶破壞后癌細(xì)胞通過組織間隙、血管和淋巴管浸潤，發(fā)展至遠(yuǎn)處，形成新生的腫瘤組織微血管，癌細(xì)胞在新的環(huán)境中生長和增殖[9-11]。在上述過程中基因或蛋白的調(diào)控至關(guān)重要，其中IFITM基因家族有可能在細(xì)胞黏附、免疫細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、癌細(xì)胞遷移等多個(gè)階段都發(fā)揮著重要的作用[12]。

IFITM3基因是該家族的成員之一，其位于人11號(hào)染色體上，堿基長度約為1.5 kb，可被Ⅰ-Ⅱ型干擾素誘導(dǎo)，編碼跨膜蛋白3[13]。該基因最早被發(fā)現(xiàn)于經(jīng)干擾素治療的神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞，其不僅可在細(xì)胞膜上表達(dá)，還被發(fā)現(xiàn)存在細(xì)胞質(zhì)中[14]。IFITM3已經(jīng)明確在生殖細(xì)胞成熟和歸巢、免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、體節(jié)形成和心臟發(fā)育等不同細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮著作用。它還可與IFITM1和IFITM2等一起抵抗流感病毒、HIV等多種病毒的侵入，具有抗病毒的作用[15-17]。最新的研究指出，IFITM3在多種腫瘤的發(fā)生和侵襲中也發(fā)揮著作用。IFITM3在結(jié)腸癌中呈高表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤分期密切相關(guān)，在伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)水平更高[18]。增殖和侵襲等生物學(xué)功能明顯活躍的腫瘤細(xì)胞IFITM3表達(dá)增強(qiáng)，因此有學(xué)者建議將其表達(dá)水平作為判斷結(jié)腸癌患者預(yù)后的指標(biāo)。在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤，IFITM3蛋白表達(dá)呈陽性，且其表達(dá)水平與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)[19]。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)顯示該基因表達(dá)水平降低后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形成、增殖和遷徙能力都明顯降低。上述研究結(jié)果均說明，IFITM3可能是一種腫瘤的致癌基因，其在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。

本研究則進(jìn)一步探討了IFITM3蛋白在肝癌組織中的表達(dá)情況及其與肝癌復(fù)發(fā)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，肝癌組織IFITM3蛋白表達(dá)陽性率和蛋白表達(dá)水平明顯高于或強(qiáng)于癌旁組織，其中肝癌組織IFITM3蛋白陽性率為72.1%，而癌旁組織為14.0%（6/43，P＜0.05）。進(jìn)一步分析不同臨床特征患者肝癌組織該基因表達(dá)水平可見腫瘤＞5 cm，TNM Ⅲ-Ⅳ期和有肝內(nèi)復(fù)發(fā)者IFITM3蛋白表達(dá)水平要明顯強(qiáng)于腫瘤≤5 cm、TNMⅠ-Ⅱ期和無肝內(nèi)復(fù)發(fā)者（P＜0.05）。此外，低分化和中分化肝癌組織IFITM蛋白陽性率均要明顯高于高分化組，伴肝內(nèi)衛(wèi)星灶者陽性率也要明顯高于無肝內(nèi)衛(wèi)星灶者（P＜0.05），提示該基因在肝癌組織呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)水平與肝癌的惡性程度呈正相關(guān)，與有關(guān)研究[20]結(jié)論一致。我們進(jìn)一步對(duì)接受根治術(shù)的HCC患者進(jìn)行1年隨訪，結(jié)果顯示HCC復(fù)發(fā)組癌組織IFITM3蛋白陽性率為 81.0%（17/21），未復(fù)發(fā)組為 22.7%（5/22），兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。綜合上述結(jié)果，我們認(rèn)為IFITM3基因在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)等過程中發(fā)揮著重要作用，其在肝癌組織中的高水平表達(dá)在一定程度上會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞的生長、增殖，提高其侵襲和轉(zhuǎn)移能力，這可能成為肝癌分子靶向治療的一個(gè)新方向。