肝細(xì)胞癌癌組織和癌旁肝組織Ep-CAM和C-Kit表達(dá)及其意義探討*

陳永其，陳 前，袁春艷，劉 軍，謝 蘊(yùn)

近年來，流行病學(xué)調(diào)查顯示肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生率明顯上升，我國(guó)2010～2017年HCC平均發(fā)病率達(dá)到374～583/10 萬[1，2]。C-Kit是重要的原癌基因，能夠激活上皮細(xì)胞膜上的絡(luò)氨酸受體，提高癌細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致癌細(xì)胞DNA擴(kuò)增和細(xì)胞持續(xù)增殖[3]。腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）是肝臟祖細(xì)胞的重要標(biāo)志物，EpCAM的上調(diào)能夠通過影響多種肝臟腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，進(jìn)而促進(jìn)了HCC患者病情的進(jìn)展[4]。本研究選擇我院收集的手術(shù)后HCC組織標(biāo)本90例，檢測(cè)了癌組織和癌旁組織EpCAM和C-Kit表達(dá)情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年3月～2017年1月我院診治的手術(shù)后HCC組織標(biāo)本90例，男59例，女31例；年齡 46～69歲，平均年齡為（59.4±10.8）歲。HCC的診斷參考《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017年版）》的標(biāo)準(zhǔn)。其中單發(fā)病灶55例、多發(fā)病灶35例；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)15例、Ⅱ級(jí)25例、Ⅲ級(jí)33例、Ⅳ級(jí) 17例；血清 AFP＞400 ng/ml者 49例、≤400 ng/ml者41例。納入標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)前患者未接受放療、化療或免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）未經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)的診斷；（2）轉(zhuǎn)移性肝癌；（3）伴有其他部位惡性腫瘤；（4）合并免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 肝組織Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)，所有組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后作連續(xù)切片，厚度約為4 μm，采用免疫組化鏈霉卵白素-生物素復(fù)合體 （strep avidin-biotin complex，sABC）法染色。抗Ep-CAM蛋白、抗C-Kit蛋白、通用型二抗、SP試劑盒和DAB顯色盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司。以陽性片或PBS代替一抗，分別作為陽性或陰性對(duì)照，在高倍顯微鏡下觀察Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白的表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果判定：Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白的陽性著色表達(dá)于細(xì)胞漿或者細(xì)胞膜，呈黃色、棕黃色或褐色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0版軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的比較采用x2檢驗(yàn)。P＜0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者肝組織Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白表達(dá)情況 見圖1、圖2。

圖1 HCC患者肝組織Ep-CAM蛋白表達(dá)情況（ABC，400×）

圖2 HCC患者肝組織C-Kit蛋白表達(dá)情況

2.2 肝組織Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白表達(dá)陽性率情況 HCC組織Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白表達(dá)陽性率顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 90例HCC患者肝組織Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白陽性率（%）情況

2.3 不同腫瘤特征HCC組織Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白表達(dá)陽性率比較 Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)分化、術(shù)前 AFP>400 ng/ml、發(fā)生血管浸潤(rùn)的癌組織Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白表達(dá)陽性率均顯著高于Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)、術(shù)前AFP≤400 ng/ml、未發(fā)生血管浸潤(rùn)的癌組織，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2、表3）。

表3 不同腫瘤特征癌組織C-Kit蛋白表達(dá)陽性率（%）比較

3 討論

C-Kit是重要的原癌基因家族成員，其結(jié)構(gòu)上包括了跨膜的免疫球蛋白樣的結(jié)合區(qū)域，以及近跨膜區(qū)域和絡(luò)氨酸激酶區(qū)域[5～7]。C-Kit表達(dá)增強(qiáng)能夠通過激活絡(luò)氨酸激酶，促進(jìn)癌細(xì)胞內(nèi)上磷酸腺苷的活化，提高了絡(luò)氨酸激酶信號(hào)通路的激活程度[8～10]?；A(chǔ)方面的研究認(rèn)為，C-Kit與癌細(xì)胞膜表面配體的結(jié)合，能夠顯著提高癌細(xì)胞的增殖速度，抑制癌細(xì)胞的分化成熟[11]。Ep-CAM是腫瘤干細(xì)胞或者祖細(xì)胞的分子標(biāo)志物，其能夠通過影響上皮細(xì)胞的異型性，提高上皮細(xì)胞的持續(xù)自我增殖能力，參與到惡性腫瘤的早期發(fā)生過程。Ep-CAM的表達(dá)還能夠激活癌細(xì)胞內(nèi)的MAPK或者NOTCH信號(hào)通路，導(dǎo)致上皮細(xì)胞周期的紊亂，提高了癌細(xì)胞快速跨越靜止期的能力[12]。部分研究者報(bào)道了C-Kit蛋白在肝癌組織中的表達(dá)情況，認(rèn)為病理學(xué)分級(jí)程度高的癌組織C-Kit蛋白的表達(dá)增強(qiáng)[13]，但對(duì)于Ep-CAM的分析研究還較少。

通過免疫組化檢測(cè)結(jié)果可見，C-Kit和Ep-CAM在HCC患者癌組織中的表達(dá)陽性率均明顯上升，顯著高于癌旁肝組織，差異較為明顯，提示C-Kit和Ep-CAM的高表達(dá)均能夠影響到HCC的發(fā)生過程。通過復(fù)習(xí)有關(guān)研究結(jié)果，我們認(rèn)為C-Kit和Ep-CAM在癌發(fā)生過程中可能有如下作用機(jī)制[14，15]：（1）C-Kit表達(dá)上調(diào)能夠?qū)е掳┘?xì)胞內(nèi)的絡(luò)氨酸受體的激活，促進(jìn)其誘導(dǎo)的癌細(xì)胞核周邊轉(zhuǎn)錄基因的激活，導(dǎo)致癌細(xì)胞核分裂速度的加快；（2）Ep-CAM表達(dá)上調(diào)能夠?qū)е掳┘?xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路的激活，提高了癌細(xì)胞的變形能力，導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)于肝臟基底膜組織和肝臟小葉組織的浸潤(rùn)能力增強(qiáng)。有研究者認(rèn)為，在肝癌組織中，C-Kit蛋白表達(dá)陽性率可平均上調(diào)35%以上，同時(shí)在合并有明顯的包膜組織浸潤(rùn)或者門靜脈轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌人群中，C-Kit蛋白的表達(dá)陽性率可進(jìn)一步的上升[16]。免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)，C-Kit和Ep-CAM主要表達(dá)于肝臟上皮腫瘤細(xì)胞的核周邊，特別是在細(xì)胞異型性較為明顯的區(qū)域，C-Kit和Ep-CAM的染色強(qiáng)度更深，推測(cè)兩者均可能影響到了肝臟上皮腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)形態(tài)特征。就不同的臨床和病理學(xué)特征分析發(fā)現(xiàn)，在組織學(xué)分級(jí)較差、術(shù)前血清甲胎蛋白水平較高或者發(fā)生了血管浸潤(rùn)的肝細(xì)胞癌患者，癌組織C-Kit和Ep-CAM表達(dá)陽性率均明顯上調(diào)，提示C-Kit和Ep-CAM的表達(dá)與HCC患者臨床和病理特征的關(guān)系，這主要是由于C-Kit在下列幾個(gè)方面的作用有關(guān)：（1）C-Kit的表達(dá)上調(diào)能夠?qū)е禄颊吒闻K上皮細(xì)胞排列極性的紊亂，導(dǎo)致組織學(xué)分型的改變，同時(shí)還能夠提高癌細(xì)胞對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力，提高癌細(xì)胞對(duì)于肝癌患者血管的浸潤(rùn)程度；（2）C-Kit的表達(dá)上調(diào)能夠提高肝癌上皮細(xì)胞的紡錘體分離速度，導(dǎo)致在癌細(xì)胞線粒體損傷過程中釋放的AFP明顯上升，促進(jìn)了術(shù)前AFP水平的上升。而不同臨床和病理學(xué)特征的HCC患者癌組織Ep-CAM蛋白表達(dá)的變化，主要在于由于其能夠提高肝癌祖細(xì)胞的活性并提高腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，進(jìn)而促進(jìn)了癌細(xì)胞對(duì)于臨近腹腔內(nèi)病灶組織的浸潤(rùn)，增加了患者的臨床分期進(jìn)展和血管浸潤(rùn)程度[17，18]。但本研究并未發(fā)現(xiàn)Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白的表達(dá)與肝癌組織包膜浸潤(rùn)的關(guān)系，提示Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白的表達(dá)并不能提高癌細(xì)胞對(duì)于肝臟包膜組織的粘附能力，這主要是由于Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白的表達(dá)對(duì)于癌細(xì)胞的遷移能力影響較小，降低了癌細(xì)胞對(duì)于包膜內(nèi)皮細(xì)胞的粘附過程。國(guó)外研究者認(rèn)為，在肝癌患者，Ep-CAM蛋白的表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的包膜轉(zhuǎn)移，考慮可能與Ep-CAM蛋白檢測(cè)靈敏度的差別或者肝癌患者基礎(chǔ)病情差別較大有關(guān)[19]。同樣，Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白的表達(dá)與肝癌患者的腫瘤病灶大小并無關(guān)系，不同腫瘤病灶大小癌組織Ep-CAM蛋白和C-Kit蛋白表達(dá)無顯著相差，說明兩種蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌發(fā)生學(xué)、腫瘤分期和是否轉(zhuǎn)移等的關(guān)系還不明確。