自體外周血干細(xì)胞移植治療乙型肝炎肝硬化患者臨床療效及其對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響

王 禪，秦 偉，戴 勇，李曉峰，張成強(qiáng)

乙型肝炎肝硬化是一種常見的慢性肝病，其肝組織病理學(xué)表現(xiàn)為纖維組織增生、結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成。研究發(fā)現(xiàn)，在急慢性肝損傷及修復(fù)過程中，干細(xì)胞的再生起著重要的作用[1，2]。近年來，干細(xì)胞移植技術(shù)在治療乙型肝炎肝硬化方面取得了一定的成就，且有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用自體外周血干細(xì)胞（peripheral blood stem cells，PBSC）移植治療肝炎肝硬化患者取得了一定的療效[3，4]。自體PBSC是一種未成熟的細(xì)胞，可在一定條件下分化為具有不同功能的組織細(xì)胞，可以進(jìn)行自我復(fù)制和更新。自體PBSC移植治療肝炎肝硬化主要是利用其具有多項(xiàng)分化潛能，可以在適當(dāng)環(huán)境下向肝細(xì)胞分化的特點(diǎn)，該治療方法明顯提高了患者的生活質(zhì)量。作為一項(xiàng)新技術(shù)，其應(yīng)用前景較好[5，6]。本研究應(yīng)用自體干細(xì)胞移植治療乙型肝炎肝硬化患者，觀察了其療效情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年4月～2017年4月我院治療的乙型肝炎肝硬化患者95例，男性63例，女性32例；年齡32～65歲，平均年齡（51.6±8.1）歲。診斷符合慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）[7]的標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)B超、CT等影像學(xué)檢查診斷為肝硬化。Child-Pugh A級(jí)33例，B級(jí)34例，C級(jí)28例。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）近期應(yīng)用過免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素；（2）嚴(yán)重的全身感染；（3）有家族遺傳性肝病史者。將入選患者隨機(jī)分為兩組，兩組性別（x2=0.632，P=0.426）、年齡（t=1.575，P=0.115）和 Child-Pugh 分級(jí)（x2=1.893，P=0.388）等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性?；颊吆炇鹬橥鈺狙芯恳勋@得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 治療方法 給予兩組護(hù)肝、降酶和恩替卡韋抗病毒治療。部分患者在此基礎(chǔ)上，給予自體PBSC移植治療。給予人粒細(xì)胞集落細(xì)胞刺激因子皮下注射，連續(xù)2 d。術(shù)前1 d，行碘過敏試驗(yàn)，雙側(cè)腹股溝備皮。使用德國(guó)費(fèi)森尤斯公司生產(chǎn)的COM-TEC血細(xì)胞分離機(jī)行外周血血細(xì)胞分離，按Auto-MNC程序，安裝一次性血細(xì)胞分離管路，連接血細(xì)胞保存液及抗凝劑，機(jī)器自動(dòng)檢測(cè)，預(yù)充，在患者雙側(cè)肘正中靜脈置入留置針，分離血細(xì)胞70～80 ml。采集完成后，在數(shù)字減影血管造影下經(jīng)股動(dòng)脈穿刺插管，經(jīng)肝固有動(dòng)脈造影，觀察肝內(nèi)血管情況。排除肝內(nèi)占位后，將采集的干細(xì)胞懸液緩慢注入肝動(dòng)脈，術(shù)后拔管，穿刺點(diǎn)加壓包扎，返回病房，穿刺側(cè)下肢制動(dòng)24 h。

1.3 臨床檢測(cè)與檢查 使用Beckman Coulter FC500全自動(dòng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群；使用法國(guó)Echosens公司生產(chǎn)的Fibroscan儀檢測(cè)肝臟硬度；采用Child-Turcotte-Pugh評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)肝功能[8]；采用ELISA法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）；采用免疫透射比濁法檢測(cè)血清超敏C反應(yīng)蛋白（hypersensitive C reactive protein，hs-CRP，試劑盒購(gòu)于北京東亞免疫技術(shù)公司）；使用美國(guó)貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的CX7生化分析儀檢測(cè)血生化指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以（±s）表示，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用[（n，%）]表示，采用 x2檢驗(yàn)；不同時(shí)間資料的比較采用重復(fù)資料的方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后肝功能指標(biāo)變化比較 治療前，兩組血生化指標(biāo)比較無顯著性差異（P＞0.05）；在治療后3 m和6 m，移植組患者血清TBIL顯著低于，而血清ALB水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.2 兩組治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化的比較 治療前，兩組外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值比較均無顯著性差異（P＞0.05）；治療后，移植組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，表2）。

表1 兩組肝功能指標(biāo)（±s）比較

表1 兩組肝功能指標(biāo)（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05

例數(shù)TBIL（μmol/L）ALB(g/L) INR移植組 移植前 48 27.5±3.9 26.5±3.6 1.4±0.8移植3 m 48 22.7±2.5① 30.8±3.7① 1.3±0.6 6 m 48 16.4±1.2① 35.2±4.0① 1.2±0.5對(duì)照組 治療前 47 27.9±4.1 26.1±3.5 1.3±0.9移植3 m 47 25.4±3.7 28.3±3.9 1.2±0.7 6 m 47 22.5±2.6 31.6±3.7 1.3±0.4

表2 兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群（±s）比較

表2 兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05

數(shù)CD3+（%）CD4+（%）CD4+/CD8+比值移植組 治療前 48 50.8±5.1 33.2±4.5 0.9±0.1移植3 m 48 61.7±7.4① 38.1±3.3① 1.4±0.1①6 m 48 67.9±6.5① 42.7±3.8① 1.5±0.2①對(duì)照組 治療前 47 51.4±5.6 32.7±5.0 0.9±0.2移植3 m 47 55.3±7.2 34.2±3.1 1.3±0.1 6 m 47 60.3±5.5 38.2±3.5 1.4±0.1例

2.3 兩組治療前后肝硬度和Child-Pugh評(píng)分的比較 治療前，兩組肝硬度和Child-Turcotte-Pugh評(píng)分比較無顯著性差異（P＞0.05）；治療后，移植組肝硬度和Child-Pugh評(píng)分均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05，表3）。

表3 兩組肝硬度和Child-Turcotte-Pugh評(píng)分（±s）比較

表3 兩組肝硬度和Child-Turcotte-Pugh評(píng)分（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05

例數(shù) 肝硬度（kPa） Child-Pugh評(píng)分移植組 治療前 48 9.6±0.3 9.6±1.9移植 3 m 48 8.3±0.2① 7.4±1.6①6 m 48 7.1±0.1① 5.5±1.5①對(duì)照組 治療前 47 9.8±0.3 9.3±2.1移植3 m 47 8.7±0.2 8.3±2.3 6 m 47 7.9±0.1 7.4±2.3

2.4 兩組血清細(xì)胞因子水平比較 治療前，兩組血清TNF-α、hs-CRP和IL-6水平比較無顯著性差異（P＞0.05）；治療后，移植組血清細(xì)胞因子水平均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05，表4）。

表4 兩組血清細(xì)胞因子水平（±s）比較

表4 兩組血清細(xì)胞因子水平（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05

IL-6（pg/mL）移植組 治療前 48 48.5±11.4 12.3±3.5 37.5±3.5移植3 m 48 36.5±9.6① 9.8±2.9 24.5±4.3①6 m 48 28.0±8.7① 6.0±2.2① 18.9±5.6①對(duì)照組 治療前 47 46.9±12.8 11.8±4.2 35.6±4.0移植3 m 47 41.5±9.8 10.3±4.0 30.9±6.3 6 m 47 36.2±8.6 8.7±3.5 25.2±7.9例數(shù)TNF-α（pg/mL）hs-CRP（mg/L）

3 討論

由乙型肝炎病毒感染而發(fā)展的終末期肝病往往都存在嚴(yán)重的肝硬化，可導(dǎo)致患者消化道出血、門靜脈高壓、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎和肝性腦病等嚴(yán)重并發(fā)癥而危及生命[9，10]。相關(guān)研究指出，乙型肝炎病毒感染可造成肝臟損害，免疫應(yīng)答反應(yīng)失衡導(dǎo)致機(jī)體炎性反應(yīng)，這些因素共同作用的結(jié)果是導(dǎo)致疾病進(jìn)入終末期[11，12]。乙型肝炎病毒侵襲機(jī)體時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的炎性因子或代謝產(chǎn)物，同時(shí)激活人體免疫應(yīng)答反應(yīng)，在清除病毒的同時(shí)引起肝臟損傷[13，14]。在乙型肝炎病毒感染引起慢性肝炎的發(fā)病過程中，往往伴有TNF-α、hs-CRP和IL-6等細(xì)胞因子的參與。機(jī)體在清除乙型肝炎病毒的過程中，T淋巴細(xì)胞亞群具有重要的作用。所以，檢測(cè)相關(guān)炎性因子和外周血T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)于治療乙型肝炎肝硬化患者具有重要的臨床意義[15，16]。應(yīng)用恩替卡韋和阿德福韋酯等抗病毒治療，只能移植病毒復(fù)制，對(duì)于已經(jīng)存在的肝硬化往往不能奏效。自體干細(xì)胞移植是近年來興起的一種新興技術(shù)。干細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)、基因修飾和誘導(dǎo)，再回輸體內(nèi)，可能歸巢至病變部位并發(fā)育成肝樣細(xì)胞而發(fā)揮生理作用。這種方法已經(jīng)廣泛試用于對(duì)肝炎肝硬化患者的治療[17，18]。

本研究在應(yīng)用恩替卡韋和基礎(chǔ)治療改善患者一般情況的基礎(chǔ)上，對(duì)部分患者再進(jìn)行自體PBSC經(jīng)肝動(dòng)脈移植治療，結(jié)果顯示，在治療后3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)，患者血清膽紅素水平顯著降低，而血清白蛋白水平明顯升高，表明自體干細(xì)胞移植可能通過合成多種細(xì)胞因子，促進(jìn)了受損肝細(xì)胞的修復(fù)，肝功能得到顯著改善。經(jīng)自體PBSC移植術(shù)治療的患者肝硬度值和Child-Pugh評(píng)分顯著降低，說明自體PBSC移植術(shù)能改善肝臟的儲(chǔ)備功能，控制肝硬化的進(jìn)展速度，提高肝硬化患者的生存質(zhì)量。此外，患者肝功能在得到明顯改善后，食欲下降、乏力、腹脹和腹水等癥狀都有了明顯的改善，顯示出使用自體外周血干細(xì)胞移植在改善肝功能和臨床癥狀方面更具有優(yōu)勢(shì)，其安全性也高。

本研究還顯示，在使用自體PBSC移植術(shù)后3個(gè)月和6個(gè)月，患者外周血CD3+、CD4+細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+細(xì)胞比值均有所提高，表明干細(xì)胞移植可以改善患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的紊亂。外周血CD4+細(xì)胞不能有效抑制自身免疫反應(yīng)，將導(dǎo)致免疫性肝損害加重，可能是由于T淋巴細(xì)胞亞群失衡可產(chǎn)生大量的炎性因子，繼而加重肝細(xì)胞受損，而自體PBSC移植術(shù)治療是一種把健康的干細(xì)胞移植到患者體內(nèi)，從而達(dá)到修復(fù)之前受損的肝細(xì)胞，促進(jìn)外周血T淋巴細(xì)胞亞群紊亂的改善。本研究結(jié)果還顯示，自體PBSC移植后的患者血清TNF-α、hs-CRP和IL-6水平降低更明顯，考慮與自體干細(xì)胞移植能有效調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群紊亂，增強(qiáng)了細(xì)胞免疫力，繼而有效降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)，而在積極改善患者局部微環(huán)境后，也可減輕肝細(xì)胞的進(jìn)一步損傷，這也可能是應(yīng)用該方法治療的患者療效更顯著的內(nèi)在機(jī)制之一[19，20]。當(dāng)然，干細(xì)胞移植治療的復(fù)雜機(jī)制還需要深入研究。