慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血清IL-10和GP73水平檢測(cè)及其臨床意義

陳海鷗，劉 適

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是在慢性肝病基礎(chǔ)上發(fā)生的急性肝功能失代償，主要表現(xiàn)為黃疸、凝血功能障礙、腹水和并發(fā)肝性腦病等為主的一組臨床癥候群[1]。ACLF患者病情進(jìn)展迅速，預(yù)后差，病死率高達(dá) 50%～90%[2，3]，嚴(yán)重危害人類健康。我國為ACLF的高發(fā)區(qū)，在我國70%～80%的ACLF患者為乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染導(dǎo)致的[4]。根據(jù) HBV-ACLF 內(nèi)在的發(fā)病機(jī)制特點(diǎn)，尋找行之有效的病情評(píng)價(jià)及預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，繼而合理地指導(dǎo)臨床治療決策，一直是肝衰竭防治研究的熱點(diǎn)。HBV相關(guān)的ACLF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與宿主機(jī)體內(nèi)的各種炎癥反應(yīng)應(yīng)答、免疫系統(tǒng)功能失衡等密切相關(guān)。近年來，細(xì)胞因子在肝衰竭發(fā)生發(fā)展過程中的作用越來越受到重視。在免疫損傷發(fā)病過程中，細(xì)胞因子起主要的調(diào)控作用，促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)與消長在肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。白細(xì)胞介素-10（interleukin 10，IL-10）主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，是一種重要的抑炎性細(xì)胞因子，對(duì)機(jī)體的免疫功能和炎癥過程具有重要的調(diào)節(jié)活性，在調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抑制作用。IL-10可以抑制巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞因子抑制劑的生成，也可以通過抑制炎性因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)和巨噬細(xì)胞導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡減輕細(xì)胞和組織損傷[5]。高爾基體蛋白73（golgi protein 73，GP73）最初是由 Kladney和Fimmel et al發(fā)現(xiàn)的一種新的跨膜糖蛋白，首次于2000年在體外克隆表達(dá)，其在正常肝細(xì)胞中呈低表達(dá)狀態(tài)，但在病變的肝細(xì)胞尤其是肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高[6]。近期研究顯示，在不同病因的肝損傷組織，GP73呈現(xiàn)不同程度的表達(dá)增強(qiáng)[7]，且其表達(dá)強(qiáng)度與肝病進(jìn)程存在著一定的相關(guān)性[8]。在對(duì)慢性HBV感染者的研究中發(fā)現(xiàn)，血清GP73水平與慢性HBV感染者病情進(jìn)展呈正相關(guān)[9]，在不同病理類型的慢性乙型肝炎肝組織中GP73水平可反映肝炎疾病進(jìn)展程度[10]。因?yàn)镮L-10是一種重要的抑炎性細(xì)胞因子，而GP73是一種與肝病的進(jìn)程存在著一定相關(guān)性的跨膜糖蛋白，其均在慢性乙型肝炎患者中表達(dá)升高，但既往研究多為靜態(tài)的表達(dá)水平觀察，尚無針對(duì)HBV-ACLF患者動(dòng)態(tài)水平觀察的報(bào)道。本研究觀察了HBV-ACLF患者血清IL-10和GP73水平的動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)，以評(píng)判它們可否能作為HBV-ACLF患者診斷和短期預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2015年1月～2017年3月在湖南省人民醫(yī)院感染病科住院的HBV-ACLF患者56例，男43例，女13；平均年齡（45.1±11.8）歲。全部患者均采取內(nèi)科綜合治療。住院或門診隨訪的慢性乙型肝炎（CHB）患者32例，男23例，女9例；平均年齡（44.2±10.4）歲。另選門診健康體檢者20例作為健康人，男13例，女7例；平均年齡（43.6±10.0）歲。健康人為體檢結(jié)果正常、既往無肝炎病史和基礎(chǔ)疾病者。CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)和肝病學(xué)分會(huì)制定的 [慢性乙型肝炎防治指南（2015版）][11]，HBV-ACLF的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)和肝病學(xué)分會(huì)制定的 [肝衰竭診治指南（2012年版）][12]。CHB具體診斷標(biāo)準(zhǔn)為：血清HBsAg陽性超過半年，HBV DNA陽性，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）持續(xù)或反復(fù)異常。HBV-ACLF具體診斷標(biāo)準(zhǔn)為：在慢性乙型肝炎基礎(chǔ)上，伴有極度乏力、食欲減退、頻繁嘔吐、腹脹等消化道癥狀，血清總膽紅素（TBIL）≥171 μmol/L和凝血酶原活動(dòng)度（PTA）＜40%。納入標(biāo)準(zhǔn)（1）符合HBV-ACLF或CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡 18～65 歲；（3）自愿配合研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)（1）合并其他病因（包括藥物性、自身免疫性、中毒性、酒精性、寄生蟲性、遺傳代謝性、循環(huán)障礙）導(dǎo)致的肝損傷；（2）合并甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒等病毒感染者；（3）急性肝衰竭、慢性肝衰竭者；（4）妊娠或哺乳期婦女；（5）入組時(shí)即合并肝腎綜合征、嚴(yán)重感染、腦水腫、消化道大出血；（6）合并其他嚴(yán)重的全身性疾病或精神??；（7）合并糖尿病或腫瘤者；（8）近3個(gè)月內(nèi)曾參加其他臨床試驗(yàn)者。各組人群性別和年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)湖南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 血清IL-10和GP73檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清IL-10水平（北京晶美生物工程有限公司）和血清GP73水平（北京熱景生物技術(shù)有限公司），實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作進(jìn)行定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用雙復(fù)孔，測(cè)定450 nm波長吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線計(jì)算各樣本IL-10和GP73水平。所有病例入組后檢測(cè)血清IL-10和GP73水平（基線）。HBV-ACLF患者治療2周后再次檢測(cè)血清IL-10和GP73水平，隨訪HBV-ACLF患者3個(gè)月，記錄患者生存情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，兩組計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料之間的比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組基線血清IL-10和GP73水平比較 CHB組血清IL-10和GP73水平顯著高于健康人，HBV-ACLF組血清IL-10和GP73水平顯著高于CHB組和健康人，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 各組基線血清IL-10和GP73水平（±s）比較

表1 各組基線血清IL-10和GP73水平（±s）比較

與健康人比，①P＜0.05；與 CHB 組比，②P＜0.05

例數(shù) IL-10（pg/ml） GP73（ng/ml）健康人 20 6.1±1.9 45.4±16.2 CHB 32 15.2±6.3① 129.7±58.1①HBV-ACLF 56 32.4±14.8①② 283.4±95.4①②

2.2 生存與死亡的HBV-ACLF患者基線血清IL-10和GP73水平比較 隨訪3個(gè)月，HBV-ACLF患者死亡23例，生存33例。生存組基線血清IL-10水平顯著高于死亡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而生存組基線血清GP73水平與死亡患者比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.36），但在治療2 w時(shí)生存組血清GP73水平顯著低于死亡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 生存與死亡組基線血清IL-10和GP73 水平（±s）比較

表2 生存與死亡組基線血清IL-10和GP73 水平（±s）比較

與死亡組比，①P＜0.05

例數(shù) IL-10（pg/ml） GP73（ng/ml）死亡基線 23 30.1±14.3 287.2±96.2 2 w 24.9±11.2 331.2±107.5生存基線 33 34.6±15.3① 279.7±94.6 2 w 30.1±14.0① 258.7±85.9①

3 討論

ACLF是我國臨床最常見的肝衰竭，其中HBV感染相關(guān)ACLF高達(dá)80%以上。ACLF病情兇險(xiǎn)、并發(fā)癥多、治療困難、病死率高[13]。及時(shí)、準(zhǔn)確地評(píng)估HBV-ACLF患者的病情及預(yù)后，從而采取有針對(duì)性的合適的治療方法，可最大程度地改善患者近/遠(yuǎn)期預(yù)后，乃至挽救患者的生命，對(duì)降低病死率和更高效地利用有限的醫(yī)療資源具有重要的臨床和社會(huì)意義。但由于HBV-ACLF的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、臨床表現(xiàn)和并發(fā)癥多樣化以及不同患者之間個(gè)體差異大等原因，現(xiàn)仍無可準(zhǔn)確反映HBV-ACLF患者病情及預(yù)后的評(píng)價(jià)系統(tǒng)或者標(biāo)志物，故不斷探索尋找可準(zhǔn)確反映HBV-ACLF病情嚴(yán)重程度和與預(yù)后判斷相關(guān)的標(biāo)志物具有極大的臨床意義。

HBV相關(guān)ACLF是一個(gè)涉及多因素、累及多器官、發(fā)病呈多階段的復(fù)雜疾病過程，其中肝細(xì)胞的大量死亡是HBV-ACLF發(fā)展過程中的核心事件，炎癥反應(yīng)是肝衰竭發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[14]。

IL-10主要由輔助性T細(xì)胞2（helper T cells 2，Th2）細(xì)胞產(chǎn)生，具有較強(qiáng)的抗炎及免疫抑制活性。它能抑制輔助性Th1細(xì)胞的活性[15、16]，減少腫瘤壞死因子-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子及淋巴細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子的表達(dá)[17]，下調(diào)局部細(xì)胞因子的水平，從而抑制粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥過程，減輕損傷。它也能抑制單核細(xì)胞表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子，促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化并產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)外來病原體產(chǎn)生耐受，在一定程度上減輕免疫和炎性損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)CHB患者血清IL-10水平較健康人明顯升高，HBV-ACLF患者IL-10水平較CHB組明顯升高，研究結(jié)果與Ye Y[19]的研究結(jié)果一致。我們也發(fā)現(xiàn)無論是基線時(shí)還是治療2周后生存組血清IL-10水平均顯著高于死亡組，說明IL-10參與了HBV-ACLF的炎癥過程，且血清高水平的IL-10的ACLF患者具有相對(duì)較好的預(yù)后。結(jié)合既往研究結(jié)果，我們推測(cè)這些現(xiàn)象可能與IL-10參與并抑制HBV-ACLF患者肝細(xì)胞的炎癥過程，減輕免疫和炎性損傷有關(guān)。在ACLF患者，肝細(xì)胞大量損傷壞死，刺激大量促炎細(xì)胞因子釋放，加重肝細(xì)胞損傷，而在這一病程中，適量的IL-10分泌能夠相對(duì)減輕肝細(xì)胞損傷的程度，對(duì)肝細(xì)胞有一定意義的保護(hù)作用。

GP73是Kladney et al在研究成人急性巨細(xì)胞病毒性肝炎病原學(xué)時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新的跨膜糖蛋白，又稱Ⅱ型高爾基體膜蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量約為45000。近年來，GP73用于診斷肝癌的研究較多，現(xiàn)越來越多的研究表明GP73在很多急性或慢性肝臟疾病中都會(huì)高表達(dá)，GP73 mRNA和蛋白在肝細(xì)胞的表達(dá)顯著上調(diào)，且血清水平與慢性肝病的進(jìn)展密切相關(guān)[20]。隨著疾病進(jìn)展，血清GP73水平有持續(xù)升高的趨勢(shì)[21]。慢性乙型肝炎患者血清GP73水平與HBeAg是否陽性或HBV DNA水平無關(guān)，而與肝臟病理損傷分級(jí)和纖維化分期呈正相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)CHB患者血清GP73水平較健康人明顯升高，HBV-ACLF患者血清GP73水平較CHB組明顯升高，研究結(jié)果與Wei H[22]的研究結(jié)果一致，提示GP73水平隨疾病進(jìn)展呈升高趨勢(shì)，血清GP73水平在一定程度上能夠反映病情的嚴(yán)重程度。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF生存組基線血清GP73水平低于死亡組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療2周后生存組血清GP73水平顯著低于死亡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示血清GP73水平較低的HBV-ACLF患者可能具有相對(duì)較好的預(yù)后，動(dòng)態(tài)觀察GP73水平變化可能對(duì)HBV-ACLF患者的短期預(yù)后判斷有一定的臨床價(jià)值。

綜上所述，HBV-ACLF患者血清IL-10水平高者預(yù)后相對(duì)較好，可能與IL-10參與并抑制HBVACLF患者肝細(xì)胞的炎癥過程，減輕免疫和炎性損傷有關(guān)。血清GP73水平較低的HBV-ACLF患者可能具有相對(duì)較好的預(yù)后，動(dòng)態(tài)觀察GP73水平變化可能對(duì)HBV-ACLF患者的短期預(yù)后判斷有一定的價(jià)值。雖然本研究得出了有意義的研究結(jié)果，但仍存在著以下缺點(diǎn)：（1）僅僅檢測(cè)了兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)患者血清IL-10和GP73水平，多次檢測(cè)動(dòng)態(tài)觀察血清細(xì)胞因子水平變化將會(huì)有更好的說服力；（2）因HBV-ACLF患者凝血功能差及病情危重，未能獲取肝組織行病理學(xué)檢查；（3）本研究未進(jìn)一步將肝衰竭分為早期、中期和晚期，不同分期患者病死率可能存在差異，從而影響對(duì)結(jié)果的分析。