慢性乙型肝炎患者HBV基因型分布及其耐藥基因突變分析*

張歡歡 ，楊 歡，沈思蘭，陳佳婕，宣彬彬

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染仍是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問題。全球慢性HBV感染人數(shù)約有4.3億，其中會(huì)演變成肝硬化和肝癌者為12%～35%[1]。如今，能夠抑制HBV感染患者病情發(fā)展的主要方法是應(yīng)用核苷（酸）類似物【nucleos（t）ide analogues，NAs】和 α- 干擾素治療[2]。拉米夫定（LAM）、阿德福韋（adefovir，ADV）、替比夫定（telbivudine，LdT）、恩替卡韋（entecavir，ETV）和替諾福韋（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）先后上市被應(yīng)用于臨床[3-7]。長期使用NAs會(huì)造成HBV變異，造成病毒耐藥。如何及時(shí)發(fā)現(xiàn)潛在的病毒耐藥特性而合理地應(yīng)用NAs治療有非常重要的臨床意義。本文主要探討了慢性乙型肝炎（CHB）患者HBV基因型分布及其病毒耐藥突變情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年8月～2017年8月我院診治的CHB患者240例，男166例，女74例；年齡為21～65歲，平均年齡為（42.7±12.5）歲。診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》的標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.2 抗病毒治療方案 本組240例CHB患者接受了NAs治療，為單藥治療、聯(lián)合治療和序貫治療。聯(lián)合治療指兩種不同作用機(jī)制或互補(bǔ)作用機(jī)制的NAs聯(lián)合使用；序貫治療或稱為轉(zhuǎn)換治療，即當(dāng)初始治療藥物出現(xiàn)療效差或耐藥突變時(shí)，換用另一種NAs治療。各種藥物治療均超過3個(gè)月。

1.3 檢測方法 患者知情同意，采集靜脈血。使用日本W(wǎng)ako公司生產(chǎn)的生化分析儀檢測血生化指標(biāo)；采用羅氏電化學(xué)發(fā)光儀及其試劑檢測血清HBV標(biāo)志物；使用羅氏Cobas-Taqman 48全自動(dòng)核酸提取檢測系統(tǒng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測血清HBV DNA（檢出下限為 20 IU/ml）；HBV 逆轉(zhuǎn)錄（RT）區(qū)的PCR擴(kuò)增以及序列測定：采用巢式PCR法擴(kuò)增RT 區(qū)，引物為 RTl：5，-AGTCAGGAAGACAGCCTAC TCC-3，RT2：5，-AGGTGAAGCGAAGTGCACAC-3。進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件：94℃2 min；94℃45 s，59℃ 1 min，72℃ 70 s，共 35 個(gè)循環(huán)。引物RT3：5，-TTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTC-3，和RT4：5，-TTCCGCAGTATGGATCGGCAG-3。進(jìn)行第二輪 PCR 擴(kuò)增，PCR 條件：94℃35 s，56℃ 1 min，72℃ 50 s，共35個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物純化后，由廣州華大基因公司完成測序；HBV基因型測定：將HBV S基因序列分別與HBV A～H各基因型的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，差異性＜4%者，歸為同一基因型；耐藥位點(diǎn)分析：應(yīng)用Blast生物信息學(xué)軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料的比較采用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHB患者血清ALT和HBV載量情況 240例CHB患者血清ALT水平為（80.3±24.6）U/L，血清HBV DNA 水平為（3.2±1.4）lg IU/ml。

2.2 不同NAs抗病毒治療患者耐藥突變發(fā)生率比較 聯(lián)合或序貫治療患者耐藥突變位點(diǎn)為rtA194T，其耐藥突變發(fā)生率顯著高于恩替卡韋治療患者（P＜0.05，表1）。

表1 不同藥物治療患者耐藥突變率（%）比較

2.3 HBV基因型和耐藥突變情況 在240例CHB患者中，B型21例（8.8%）、C型 216例（90.0）、D型3例（1.2%）。在發(fā)生耐藥突變的91例患者中，B型6例（6.6%）、C型83例（91.2%）、D 型 2例（2.2%）。三種HBV基因型感染患者耐藥突變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=1.22，P＞0.05）。在發(fā)生耐藥突變的6例B型患者中，有2例（33.3%）發(fā)生了多重耐藥突變；在發(fā)生耐藥突變的83例C型患者中，有15例（18.1%）發(fā)生了多重耐藥突變；D型感染者未發(fā)生多重耐藥突變病例。

3 討論

急性乙型肝炎患者康復(fù)之后體內(nèi)仍會(huì)存在強(qiáng)烈的針對(duì)HBV的特異性應(yīng)答，盡管如此，由于體內(nèi)存在的失去轉(zhuǎn)錄活性的共價(jià)閉合環(huán)狀HBV DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），而使病毒處于潛伏狀態(tài)，可能在應(yīng)激狀態(tài)下非常容易再次激活HBV感染。治愈CHB患者，理論上要包括兩個(gè)層面，既要消除肝細(xì)胞表面的HBsAg，又要消除肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA[9]。但是，到目前為止，還沒有能夠直接將cccDNA清除的抗HBV藥物，也還沒有被公認(rèn)為能夠穩(wěn)定檢測cccDNA的方法[10]。所以，比較現(xiàn)實(shí)的目標(biāo)是先實(shí)現(xiàn)“免疫學(xué)治愈”，類似于急性肝炎患者緩解后的免疫功能狀態(tài)，也就是通過治療后持續(xù)性的病毒學(xué)應(yīng)答將病毒水平壓得很低，讓肝損傷保持持續(xù)的緩解狀態(tài)，降低肝細(xì)胞癌化的風(fēng)險(xiǎn)，這種療效也叫做“臨床治愈”和“功能性治愈”[11]。

功能性治愈的核心是消滅HBsAg甚至是使其發(fā)生血清轉(zhuǎn)換，表明在停藥之后疾病緩解是持續(xù)性的。乙型肝炎病毒感染是導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌的重要原因。32%HBV感染者會(huì)發(fā)生肝損傷而導(dǎo)致CHB，全球由CHB發(fā)展為肝細(xì)胞癌者占到85%，清除HBsAg會(huì)降低肝細(xì)胞癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，血清HBV DNA轉(zhuǎn)陰患者發(fā)生肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)大約降低4倍[12]。研究發(fā)現(xiàn)，血清HBeAg陰性患者在HBV DNA水平從2000 IU/ml降到1000 IU/ml時(shí)，會(huì)明顯降低癌變的風(fēng)險(xiǎn)[13]。反之，當(dāng)血清HBV DNA上升超過1000IU/ml時(shí)，一般預(yù)示著可能會(huì)出現(xiàn)肝炎以及疾病的進(jìn)展。如果在接受治療之后患者血清HBsAg水平不超過100 IU/ml，通常情況下可以看作為不會(huì)導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)。另外，血清HBsAg水平也會(huì)影響體內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA載量[14]。血清HBsAg水平可以作為宿主抵抗乙型肝炎病毒感染能力的評(píng)估指標(biāo)，可能具有潛在的評(píng)估CHB患者遠(yuǎn)期預(yù)后的能力。所以，當(dāng)前治療CHB患者獲得理想效果是血清HBsAg轉(zhuǎn)陰或者是伴HBsAg血清轉(zhuǎn)換[15]。

早期全球的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Peg IFN-α聯(lián)合LAM連續(xù)治療CHB患者46～50周，能很快抑制病毒復(fù)制，并且具有更低的耐藥風(fēng)險(xiǎn)，但是其缺點(diǎn)在于停止給藥之后22～24周發(fā)現(xiàn)與不聯(lián)合LAM的單獨(dú)藥治療者，血清HBsAg陰轉(zhuǎn)和血清轉(zhuǎn)換效果更差些[16]。在另外的前瞻性開放性試驗(yàn)中使用ADV聯(lián)合Peg IFN-α治療46周，對(duì)患者進(jìn)行跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)2年后CHB患者血清HBsAg陰轉(zhuǎn)率為15%，該研究沒有設(shè)置單獨(dú)給藥組，所以沒有證據(jù)能夠證明聯(lián)合使用的效果更好[17]。隨著治療技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)合使用耐藥屏障更高的NAs與IFN-α聯(lián)合，能否獲得更好的協(xié)同作用受到越來越多的關(guān)注。當(dāng)前，有報(bào)道關(guān)于聯(lián)合TDF或單獨(dú)使用IFN-α的對(duì)比治療發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療70周要比單獨(dú)治療46周患者在血清HBsAg陰轉(zhuǎn)率方面高出4倍，而單獨(dú)使用TDF者無陰轉(zhuǎn)。研究發(fā)現(xiàn)在參與聯(lián)合治療的患者，大部分獲得應(yīng)答者都是A基因型感染者，其他型感染者則少有應(yīng)答。所以，這種治療是否適合亞裔人群，還需要不斷的探索和評(píng)價(jià)[18]。

臨床上，比較常見的耐藥是應(yīng)用LAM治療，因?yàn)樵撍庨_始使用的時(shí)間比較早，連續(xù)4年單獨(dú)使用該藥物進(jìn)行治療會(huì)有接近55%～65%患者發(fā)生耐藥，LAM和Ldt耐藥是交叉的，還會(huì)促進(jìn)ETV和ADV使用者的耐藥。當(dāng)前，ETV初始治療者5年內(nèi)發(fā)生耐藥率只有1.3%，但是隨著治療時(shí)間持續(xù)，特別是經(jīng)過LAM治療無效轉(zhuǎn)為ETV治療的患者會(huì)有非常明顯的耐藥率提高[19]。發(fā)生耐藥性與病毒基因突變的區(qū)域有關(guān)。rtM 204V、rtl 180M、rtM2041發(fā)生突變并且任意在rtT184、rtS202，rtM250中一個(gè)點(diǎn)上被替換掉氨基酸就可以判斷為患者對(duì)ETV發(fā)生耐藥。如果出現(xiàn)同時(shí)超過兩個(gè)點(diǎn)被替換，那么病毒株將會(huì)成倍地降低對(duì)藥物的敏感性。

研究發(fā)現(xiàn)，rtT 184A/L/F/M/C突變、rtM 250V/L突變和rtS 202G突變都會(huì)表現(xiàn)出最高倍數(shù)的耐藥顯型（＞90倍）基因表達(dá)，基本上都會(huì)合并出現(xiàn)rtM 204V耐藥基因突變，而一般不會(huì)以rtM 204I基因突變?yōu)榛A(chǔ)框架[20]。在rtT 184I突變出現(xiàn)的時(shí)候，一般rtM 204I突變也會(huì)存在，這種情況對(duì)ETV的敏感度下降18倍，而帶有rtM 204I的突變株應(yīng)該仍對(duì)ETV存在敏感性。同時(shí)，含有rtT 184S的耐藥株對(duì)ETV的敏感性也下降了11～14倍。雖然臨床上使用核苷酸類似物抗乙型肝炎病毒治療能夠起到抑制病毒復(fù)制和控制肝功能的效果，但是仍存在一個(gè)較為嚴(yán)重的問題就是使用藥物一段時(shí)間后會(huì)產(chǎn)生耐藥問題。

本研究結(jié)果顯示，240例CHB患者血清ALT水平為（80.3±24.6）U/L，血清 HBV DNA 水平為（3.2±1.4）lg IU/ml。單用應(yīng)拉米夫定治療者發(fā)生耐藥突變率為40.0%，突變位點(diǎn)常見的為rtL80I/V、rtVl73L、rtLl80M、rtM204V/I和rtV207I，單用阿德福韋治療者發(fā)生耐藥突變率為47.8%，突變位點(diǎn)為rtAl81T/V、rtS213T/N、rtV214A、rtQ215S/H/P、rtl233V、rtN236T、rtP237H、rtN/H238A/K/D/S，單用恩替卡韋治療者發(fā)生耐藥突變率為14.3%，為最低，突變位點(diǎn)為rtM204I，單用替比夫定治療者發(fā)生耐藥突變率為41.7%，突變位點(diǎn)為rtI169T、rtL180M、rtT184G/S/A/I/L/F、rtS202I/G、rtM204V、rtM250V/I/L，聯(lián)合或序貫治療者發(fā)生耐藥突變率51.0%，突變位點(diǎn)為rtA194T；在240例CHB患者中，HVB基因型感染者21例（8.8%）、C型216例（90.0）、D型3例（1.2%）。在發(fā)生耐藥突變的91例患者中，B型6例（6.6%）、C型83例（91.2%）、D型2例（2.2%），三種 HBV 基因型耐藥突變率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=1.22，P＞0.05）。在發(fā)生耐藥突變的6例B型感染者中，有2例（33.3%）發(fā)生了多重耐藥突變，在發(fā)生耐藥突變的83例C型感染者中有15例（18.1%）發(fā)生了多重耐藥突變，而D型感染者沒有發(fā)生多重耐藥突變的病例。結(jié)果表明病毒產(chǎn)生耐藥性之后，出現(xiàn)了耐藥基因變異，這些變化可能增加了導(dǎo)致慢性肝炎逐步向肝硬化或肝癌發(fā)展的可能性。所以，臨床上，加強(qiáng)檢測和分析這些基因的突變變化，及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥基因并采取相應(yīng)的措施調(diào)整治療方案，對(duì)于治療效果的提高有很大的臨床意義。