不同HBV感染轉(zhuǎn)歸人群外周血PD-1拷貝數(shù)分布研究*

李 芳，鄒桂舟，葉 珺，郜玉峰

宿主遺傳變異的多樣性涉及基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）等[1～3]。CNVs是指在個體基因組中，一段DNA片段的拷貝數(shù)在亞微觀范疇內(nèi)發(fā)生了變異，導(dǎo)致相對于參考基因組有著不同的拷貝數(shù)，這里的DNA片段均大于1kb，這些突變可能是刪除或復(fù)制或插入的結(jié)果，它們通常覆蓋了大約15%人類基因組。除了影響DNA序列的拷貝數(shù)（copy number，CN）外，CNVs還可以通過數(shù)量或位置的改變影響基因表達，并進一步影響到個體疾病的易感性和疾病進展[4-6]。程序性死亡受體-1（programmed cell death-l，PD-1）分子是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個具有負性調(diào)節(jié)作用的共刺激信號分子，是一種I型跨膜糖蛋白，屬于B7/CD28家族中的一員，含有N-端和C-端兩個酪氨酸殘基[7～10]?；罨腂 細胞、自然殺傷細胞（nature killer cell，NK）細胞和CD4+T細胞等表面可表達PD-1。既往有研究表明PD-1/PD-L1介導(dǎo)的信號通路對于HBV感染慢性化及疾病轉(zhuǎn)歸有重要的作用[11]。PD-1一共有50多個SNP基因位點，其中多個基因位點多態(tài)性與HBV感染后不同轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[12]。本研究采用Accu Copy檢測技術(shù)分析了HBV感染不同臨床型人群外周血PD-1基因拷貝數(shù)分布頻率的差異，以了解機體免疫遺傳學(xué)背景對HBV感染轉(zhuǎn)歸的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2014年6月～2017年6月我院診治的漢族HBV感染者1109例，其中809例為血清HBsAg陽性超過6個月的慢性感染者，另300例為既往有急性或CHB病史，但血清HBsAg陰性，HBsAb陽性或陰性，HBcAb陽性，HBV DNA低于最低檢測限，血清ALT水平正常，被定義為HBV感染恢復(fù)。在809例慢性HBV感染者中，437例為CHB患者，249例為LC患者，123例為HCC患者。排除藥物、自身免疫、酒精、合并其他嗜肝病毒感染造成的肝損傷，排除妊娠婦女。所有研究對象簽署知情同意書，本課題已通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2 外周血PD-1基因拷貝數(shù)檢測 采集受試者外周血2 ml，置于EDTA-K2管，使用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，純化，置于-20℃凍存。采用多重AccuCopy技術(shù)檢測PD-1基因2個目的DNA片段CNVs。采用文獻報道[13]的方法，合成PD-1特異性引物和競爭模板（表1）。根據(jù)Genesky生物技術(shù)要求，設(shè)計并合成了12個目標(biāo)段的競爭DNA，進行多重PCR擴增，將PCR產(chǎn)物稀釋20倍后，上樣至ABI3 730XL測序儀（Applied Biosysterns公司，美國），經(jīng)PCR擴增，采用毛細管電泳法分離DNA片段，采用GeneMapper4.0軟件分析。通過目的基因與內(nèi)參基因S/C值比較，進行均一化處理，得到絕對定量的PD-1基因拷貝數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 16.0軟件分析，采用卡方檢驗比較各組之間PD-1拷貝數(shù)分布頻率；選擇5個可能影響慢性HBV感染結(jié)局的指標(biāo)（HBeAg滴度、年齡、性別、病毒載量、PD-1拷貝數(shù)），行Logistic回歸分析，運用邏輯回歸模型分析變量與疾病結(jié)局的關(guān)系，P＜0.05提示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 PD-1特異性引物和競爭模板

2 結(jié)果

2.1 各組人群基線資料 見表2。

表2 各組人群基線資料（n，±s）

表2 各組人群基線資料（n，±s）

例數(shù) 男性/女性 年齡（歲） 95%CI感染恢復(fù) 300 165/135 45.26±15.54 43.94～47.03 CHB 437 350/87 34.09±12.70 32.89～35.28 LC 249 196/53 50.27±13.31 48.62～51.93 HCC 123 101/22 53.75±12.53 51.49～55.98

2.2 各組PD-1基因拷貝數(shù)分布頻率比較 將2個拷貝和3個拷貝合并為多倍體，1拷貝被認為是單倍體。與HBV感染恢復(fù)組比，LC組多倍體顯著升高（x2=4.473，P=0.034）；CHB、LC 和 HCC 患者外周血PD-1基因拷貝數(shù)分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（x2=3.256，P=0.196，表3）。

表3 各組PD-1基因拷貝數(shù)分布頻率（%）比較

2.3 影響HBV感染結(jié)局的因素分析 將年齡、性別、PD-1的CN、HBV DNA和HBeAg滴度賦值，建立多元回歸方程，以CHB作為估計參數(shù)，結(jié)果影響疾病預(yù)后的因素是年齡（x2=126.717，P=0.000）和 HBV DNA（x2=44.155，P=0.000，表4）。其中年齡≥40歲是由CHB進展至LC或HCC的危險因素，而HBeAg陰性患者更有可能由CHB進展至HCC。

表4 多元Logistic回歸分析

3 討論

近些年來的研究發(fā)現(xiàn)，PD-1是一種負性調(diào)節(jié)作用的共刺激信號分子，它以單體的形式表達于CD4+和CD8+T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、骨髓細胞和樹突狀細胞等細胞表面[14，15]。通常，PD-1與其兩個配體PD-L1和PD-L2共同組成信號通路以發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。研究表明，在慢性HBV感染患者肝組織肝細胞表面可以出現(xiàn)PD-L1的過度表達，通過PD-1/PD-L1的信號通路進一步導(dǎo)致CD8+T細胞的功能受到抑制，從而發(fā)生T細胞功能的耗竭，淋巴細胞分泌的一些抗病毒細胞因子如IFN-γ和TNF-α的表達減少，從而導(dǎo)致了病毒感染呈現(xiàn)持續(xù)存在的狀態(tài)[16]。同時，PD-1的上調(diào)則有利于Th2細胞因子產(chǎn)生IL-10，而降低Th1細胞分泌IFN-γ，從而也可導(dǎo)致病毒感染的慢性化[17]。除此之外，不同宿主之間的免疫反應(yīng)程度存在不同，因此研究者們認為HBV感染的結(jié)果受到病毒和宿主遺傳多樣性的影響，其中包括SNP和基因的CNVs。本研究通過對HBV感染不同臨床型人群外周血PD-1的CNVs的檢測和統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)HBV感染恢復(fù)人群與LC組之間在PD-1基因拷貝數(shù)分布頻率上存在著差異，即與HBV感染恢復(fù)者比，LC組PD-1多倍體所占比例更高，而其他各組間PD-1拷貝數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。研究發(fā)現(xiàn)，17.7%基因多態(tài)性與拷貝數(shù)變異有直接相關(guān)性，并且這些拷貝數(shù)變異大部分與基因的表達呈正相關(guān)關(guān)系，其中僅僅大約有15%表現(xiàn)出負相關(guān)關(guān)系[18]。針對PD-1基因拷貝數(shù)與HBV mRNA水平進行的比較分析發(fā)現(xiàn)兩者基因表達水平之間并不是簡單的正相關(guān)或負相關(guān)關(guān)系，而是存在著十分復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系[19]。根據(jù)上述理論，結(jié)合本研究結(jié)果提示慢性HBV感染可能與PD-1的高表達有關(guān)，發(fā)生這種改變考慮與機體的自我保護性調(diào)節(jié)作用有關(guān)。一方面機體長期受HBV感染，導(dǎo)致病毒特異性T淋巴細胞PD-1表達增加，從而產(chǎn)生一種保護性的調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致機體免疫應(yīng)答下調(diào)，避免持續(xù)活化的免疫應(yīng)答導(dǎo)致機體組織產(chǎn)生免疫病理性損傷，但同時另一方面，PD-1信號通路的持續(xù)活化又抑制了CD8+T淋巴細胞功能，使其發(fā)生功能衰竭，從而使乙型肝炎病毒難以完全清除，導(dǎo)致了感染的持續(xù)化[20]。這種調(diào)節(jié)機制與本研究結(jié)果相符合，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PD-l基因拷貝數(shù)高的人群主要集中在肝硬化組，因此我們認為很有必要對PD-1基因呈多拷貝數(shù)的慢性HBV感染者進行長期的追蹤及隨訪，以及時觀察疾病的進展，防止其進展至終末期肝病階段。同時，我們希望可以通過阻斷PD-l/PD-L1這條信號通路來提高機體特異性T淋巴細胞的功能，從而有利于清除的病毒，這也為進一步進行慢性HBV感染的防治研究開辟了新的方向。雖然我們研究發(fā)現(xiàn)HBV感染恢復(fù)者與LC組外周血PD-1基因分布頻率存在拷貝數(shù)差異，但將慢性HBV感染組再根據(jù)疾病進展分為CHB、LC和HCC三組，并進行統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)這三組之間PD-1基因拷貝數(shù)分布頻率無明顯差異，我們綜合分析其原因可能有以下幾種：1，CNVs并不是控制HBV感染預(yù)后的唯一遺傳易感因素，CNVs與基因表達之間存在著十分復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。在未來進行研究時可將多種遺傳易感因素聯(lián)合起來進行關(guān)聯(lián)研究；2，影響慢性乙型肝炎感染后轉(zhuǎn)歸的因素除了考慮其HBV DNA水平外，同時還要考慮HBV RNA及其蛋白水平，因此將三者聯(lián)合起來進行研究可更明確基因的調(diào)節(jié)是如何進一步影響疾病轉(zhuǎn)歸的；3，本研究為單中心選擇樣本，影響結(jié)果的因素較多，比如診斷的標(biāo)準(zhǔn)化、人口學(xué)配比、診斷和檢測試劑的統(tǒng)一、不同臨床疾病診斷的統(tǒng)一及其臨床分度或分期、并發(fā)癥或合并癥、受教育程度、經(jīng)濟狀況、治療藥物選擇、不同治療方法等等，都可能會出現(xiàn)選擇偏倚或影響結(jié)果分析。所以，在今后的研究中需要進一步擴大樣本量，從而可以更有效地統(tǒng)計分析研究結(jié)果。

既往研究發(fā)現(xiàn)PD-1表達水平與肝臟發(fā)生炎癥損傷的程度存在相關(guān)。所以，我們認為宿主PD-1基因多態(tài)性在不同HBV感染轉(zhuǎn)歸人群是不同的，從而可以在某種程度上影響個體的疾病表現(xiàn)形式，值得我們展開進一步研究。在今后的研究中，不僅需要觀察外周血T淋巴細胞PD-1 mRNA水平，更需要進一步研究在肝組織內(nèi)T淋巴細胞PD-1表達情況以及PD-1表達與肝組織炎癥程度的相關(guān)性，并且進一步準(zhǔn)確地分析PD-1 CNVs對于PD-1基因表達的影響，從而進一步開展基因拷貝數(shù)的功能性研究，以闡明PD-1在乙型肝炎病毒感染過程中的具體作用機制，為慢性乙型肝炎的防治提供一個新的思路和研究方向。