小劑量二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的建立

玉蘇甫·吐?tīng)栠d，趙燕霞

在人體研究肝纖維化過(guò)程往往受到多種限制，所以實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型的應(yīng)用成了研究者的必然選擇[1～5]。本研究采用二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）誘發(fā)大鼠肝纖維化模型，以期為預(yù)防和防治肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展提供一種理想的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器與試劑 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量（160±20）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK（新）2003-001]。S22PS分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司），TGL-16G高速常壓離心機(jī)、TDL-5A低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），K-S2.4型電熱恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠），RM-2135型石蠟切片機(jī)（德國(guó) Leica公司），EG-1150C型組織包埋機(jī)（德國(guó) Leica公司），CH型OLYMPUS光學(xué)顯微鏡（Olympus公司），Image Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)（Olympus公司）。檢測(cè)SOD、GSH-PX、MDA 試劑盒（南京建成生物工程研究所），戊巴比妥鈉和DEN（Sigma公司）。

1.2 血清ALT和AST含量測(cè)定 使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.3 血清SOD、GSH和MDA測(cè)定 按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說(shuō)明由專(zhuān)人檢測(cè)。

1.4 肝纖維化模型的建立 將30只動(dòng)物隨機(jī)分為正常組和模型組，每組15只。給予模型組動(dòng)物0.1 mg/mL低濃度DEN溶液（用滅菌蒸餾水配制）腹腔注射，1次/d，連續(xù)11 w；給予正常組大鼠滅菌生理鹽水注射，連續(xù)11 w。在11 w末實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，給予大鼠1%戊巴比妥鈉0.3ml/100 mg腹腔注射麻醉，剖開(kāi)腹部，分離腹主動(dòng)脈取血，-80℃保存待檢。處死大鼠后，從肝左葉切取一塊大小 1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm組織塊，迅速置于10%甲醛溶液中固定，5 d后取材、石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。取體積小于1 mm3的肝組織塊，用4%戊二醛和1%鋨酸雙固定，丙酮梯度脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，在電鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 Excel整理數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，即P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清指標(biāo)變化的比較 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組動(dòng)物血清ALT和AST水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.001），血清SOD和GSH水平較對(duì)照組減低，而MDA水平顯著升高，均有顯著性差異（P＜0.01，表1）。

2.2 肝組織病理學(xué)變化 模型組動(dòng)物肝組織出現(xiàn)肝細(xì)胞變性、細(xì)胞增生、壞死和假小葉形成（圖1和圖2），正常組肝臟細(xì)胞正常，未見(jiàn)水腫、腫脹、壞死（圖3和圖4）。

2.3 肝組織超微結(jié)構(gòu)的變化 模型組主要以肝細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)增加、細(xì)胞器數(shù)量減少、基質(zhì)密度降低和肝糖元減少表現(xiàn)為主（圖5和圖6）；正常組肝細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞器分布均勻，肝糖原數(shù)量基本正常（圖7和圖8）。

表1 兩組血清指標(biāo)（±s）比較

表1 兩組血清指標(biāo)（±s）比較

與正常組比，①P＜0.001；②P＜0.01

只 ALT（U/L） AST（U/L） SOD（U/mg Prot） GSH（U/mg Prot） MDA（nmol/mg prot）正常組 15 56.51±11.2 63.26±10.0 178.57±22.8 45.16±2.9 3.76±0.7模型組 15 410.08±93.6① 399.7±90.9① 83.08±22.0② 24.65±2.0② 9.78±2.0②

圖1 模型大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)（HE，100×） 肝細(xì)胞壞死明顯，假小葉形成且界限清晰，見(jiàn)明顯的纖維組織增生

圖2 模型大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)（HE，100×） 正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，可見(jiàn)大小不一的肝細(xì)胞團(tuán)和假小葉結(jié)構(gòu)形成，有不同程度的纖維組織增生，細(xì)胞間隙增寬，還可見(jiàn)到炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肝細(xì)胞進(jìn)一步水腫、變性、壞死，部分小膽管內(nèi)見(jiàn)膽汁淤積

圖3 正常大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)（HE，100×） 肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，圍繞小葉中央靜脈呈放射狀排列，細(xì)胞大小一致，肝血竇無(wú)狹窄，肝小葉及匯管區(qū)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)水腫或腫脹的肝細(xì)胞，未見(jiàn)壞死的肝細(xì)胞，無(wú)明顯纖維組織增生或纖維化

圖4 正常大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)（HE，100×）

圖5 肝組織超微結(jié)構(gòu)變化（9400×）模型組膽管上皮輕微水腫，肝細(xì)胞中度水腫，基質(zhì)密度降低，肝糖元減少，異染色質(zhì)輕微邊集，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)基本完整，肝血竇內(nèi)壁水腫，肝血竇面微絨毛減少，肝細(xì)胞間隙增寬

圖6 肝組織超微結(jié)構(gòu)變化（9400×）模型組肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)線粒體增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)基本完整，異染色質(zhì)邊集。肝血竇面微絨毛明顯減少，肝細(xì)胞水腫明顯，基質(zhì)密度明顯降低。肝糖元明顯減少，毛細(xì)膽管明顯擴(kuò)張，肝血竇內(nèi)壁水腫，膽管上皮水腫。肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)密度較深的顆粒

圖7 肝組織超微結(jié)構(gòu)變化（9400×） 正常肝細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞器分布均勻，毛細(xì)血管輕微擴(kuò)張，肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)腫脹，肝細(xì)胞矢狀面微絨毛未見(jiàn)異常

圖8 肝組織超微結(jié)構(gòu)變化（9400×）

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的中間環(huán)節(jié)。肝纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但肝星狀細(xì)胞激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)[6]。肝損傷是引發(fā)肝纖維化的始動(dòng)環(huán)節(jié)。肝細(xì)胞和其他肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞旁分泌釋放一些細(xì)胞因子激活肝星狀細(xì)胞，活化的肝星狀細(xì)胞增生，合成細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)表達(dá)部分細(xì)胞因子自分泌，共同參與調(diào)控過(guò)程。其結(jié)果，肝細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度彌漫性沉積，形成肝纖維化肝硬化化[7]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，診斷和防治方法進(jìn)行了不懈的探索。已有資料證明，肝臟慢性損傷過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)累積所形成的肝纖維化，甚至肝硬化是可逆的。但是迄今抗肝纖維化的臨床治療尚無(wú)突破，更引起人們對(duì)肝纖維化研究的重視化[8]。

眾所周知，DEN作為大鼠肝纖維化模型的誘導(dǎo)劑是研究應(yīng)用最為廣泛的化學(xué)制劑。研究表明，它是一種具有肝毒性、細(xì)胞毒性和免疫毒性藥物，且對(duì)肝臟有明顯的親和性，使肝臟發(fā)生中毒性改變[14，15]。血清AST和ALT含量變化對(duì)肝功能損害程度有一定的參考價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)研究提示模型組血清ALT和AST含量較對(duì)照組成倍的升高，考慮模型組肝功能不同程度的損害，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16，17]。DEN是一種選擇性的肝臟毒性物質(zhì)，通過(guò)氧化細(xì)胞蛋白質(zhì)DNA以及生物膜脂質(zhì)，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，形成脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA，故測(cè)定肝組織中MDA可以間接反映肝細(xì)胞的損傷程度[18]。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與正常組比較，模型組MDA含量明顯升高，SOD含量明顯下降，其發(fā)生機(jī)制可能是SOD與MDA之間的平衡被打破，組織不能抗氧化清除自由基，造成肝纖維化的形成。

GSH是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種含硒抗氧化酶，可通過(guò)特異性催化GSH對(duì)氫化氧化物的還原反應(yīng)，而消除細(xì)胞內(nèi)有害的過(guò)氧化代謝產(chǎn)物，以阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，從而對(duì)保護(hù)細(xì)胞代謝的正常進(jìn)行起到重要作用。隨著機(jī)體內(nèi)能導(dǎo)致肝纖維化的自由基水平的不斷增多，GSH-Px活性降低，因此可以作為評(píng)價(jià)肝纖維化的又一個(gè)重要指標(biāo)[19]。肝臟病理學(xué)檢查結(jié)果主要是發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)不同程度的肝組織內(nèi)纖維組織增生加重，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失和形成典型的假小葉結(jié)構(gòu)。目前，很多學(xué)者認(rèn)為肝臟假小葉形成，即為肝硬化形成[20，21]。肝臟超微結(jié)構(gòu)方面的改變主要以肝細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)增加、細(xì)胞器數(shù)量減少、基質(zhì)密度降低和肝糖元減少等變化，提示肝細(xì)胞有進(jìn)一步的損傷，誘導(dǎo)肝纖維化的形成，與文獻(xiàn)[22～24]報(bào)道吻合。

本實(shí)驗(yàn)表明，低濃度DEN溶液可以建立穩(wěn)定的肝纖維化大鼠模型，其過(guò)程相似于人類(lèi)纖維化的發(fā)生過(guò)程，且其肝纖維化形成率高，動(dòng)物死亡率低，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，便于進(jìn)行藥物干預(yù)和療效分析。因此，該模型是較為理想的肝纖維化研究模型。