胰腺癌組織中PSAT1表達(dá)及其介導(dǎo)的細(xì)胞增殖 侵襲作用機(jī)制研究*

聶釗 李嵐 楊蘭群 崔德軍 錢利 葉麗敏 楊倩 張德林 褚明亮 曾憲春

胰腺癌是一種惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤，根據(jù)中國國家癌癥中心發(fā)布的最新數(shù)據(jù)，我國胰腺癌發(fā)病率居惡性腫瘤第10位，死亡率居第5位［1］。盡管近20年癌癥診療技術(shù)得到了快速發(fā)展，但是胰腺位置較深，加之起病隱匿，早期診斷胰腺癌仍然是臨床的難題之一。當(dāng)出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)往往已是中晚期，患者5年生存率低于8%［2-3］。因此研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找可靠的早期診斷和預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物，是改善胰腺癌預(yù)后的關(guān)鍵。高糖酵解水平（Warburg效應(yīng)）是惡性腫瘤的重要特征［4］，腫瘤細(xì)胞通過Warburg效應(yīng)為細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖提供足夠的能量。研究證實(shí)［5］，Warburg效應(yīng)能誘導(dǎo)一系列編碼糖酵解代謝酶的基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生物量累積和腫瘤細(xì)胞增殖。磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶1（phosphoserine aminotransferase 1，PSAT1）是絲氨酸合成的限速酶，在3-磷酸甘油酸酯轉(zhuǎn)化為絲氨酸過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。在這一轉(zhuǎn)化過程中，絲氨酸能為腫瘤細(xì)胞異常生長(zhǎng)和增殖提供充足的能量供應(yīng)，因此PSAT1與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。PI3K/Akt/mTOR通路是細(xì)胞物質(zhì)、能量代謝主要信號(hào)通路，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖中發(fā)揮重要作用，PI3K/Akt/mTOR通路也被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的主調(diào)節(jié)器［7-8］。本研究通過檢測(cè)胰腺癌組織和細(xì)胞PSAT1表達(dá)水平，并從PI3K/Akt/mTOR通路角度出發(fā)，初步探討PSAT1在胰腺癌增殖、侵襲中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 采集2013年7月至2017年7月在貴州省人民醫(yī)院行手術(shù)切除的98例胰腺癌患者組織樣本，包括癌組織和配對(duì)的癌旁組織（距腫瘤切緣≥1 cm）；樣本組織取出后立即置于液氮中冷凍，-80℃保存供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。所有患者術(shù)前完善雙源CT胰腺增強(qiáng)掃描，并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為胰腺腺癌。術(shù)前未進(jìn)行化療、放療或其他抗癌治療，排除轉(zhuǎn)移性胰腺癌、伴有其他惡性腫瘤或自身免疫性疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：GZRY20130513），所有患者術(shù)前均簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞來源與培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3、PANC1、SW1990細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），正常胰腺腺泡細(xì)胞AR42J購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。BxPC-3、SW1990、PANC1細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基，AR42J細(xì)胞接種于RPMI-1640。DMEM培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基均含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和鏈霉素，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中以37℃、5%CO2條件培養(yǎng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Gibco公司），RPMI-1640培養(yǎng)液、Lipofectamine 2000脂質(zhì)體、Opti-MEM、TRIzol試劑（美國Invitrogen公司），PSAT1-siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），Cell Counting Kit-8（Dojindo公司），Transwell小室（康寧公司），RIPA裂解液、BCA試劑（碧云天生物技術(shù)研究所），ECL檢測(cè)試劑盒（Thermo scientific公司），鼠抗人PSAT1單克隆抗體、鼠抗人Akt、mTOR、p-Akt、pmTOR單克隆抗體（美國Abcam公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（武漢博士德生物工程公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織PSAT1表達(dá) 石蠟包埋的樣本組織經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；加入檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）加熱30 min修復(fù)抗原，3%H2O2孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶，加入5%山羊血清封閉2 h。樣本組織加入PSAT1抗體4℃孵育過夜，次日再加入二抗孵育1 h，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。結(jié)果判定：按照染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞染色面積對(duì)PSAT1表達(dá)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，染色強(qiáng)度：0分，陰性；1分，弱染色；2分，中等染色；3分，強(qiáng)染色。染色面積：0分，0～5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，＞50%；最終評(píng)分為染色強(qiáng)度評(píng)分×染色面積。參考 De Marchi等［9］報(bào)道，最終評(píng)分≥3 分為PSAT1表達(dá)陽性，＜3分為PSAT1表達(dá)陰性。

1.2.2 臨床資料整理與術(shù)后隨訪 收集患者臨床資料，包括性別、年齡、手術(shù)時(shí)腫瘤大小、分化程度、腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、神經(jīng)侵犯情況等。患者術(shù)后進(jìn)行規(guī)律隨訪，本研究隨訪截止日期為2018年4月30日，隨訪時(shí)間5～53個(gè)月，中位隨訪時(shí)間17.3個(gè)月。記錄患者總生存期和無病生存期，定義總生存期為術(shù)后第2 d至死亡或末次隨訪的時(shí)間，無病生存期為術(shù)后第2 d至胰腺癌首次復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時(shí)間。

1.2.3 小干擾RNA（siRNA）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 利用siRNA技術(shù)敲低細(xì)胞PSAT1表達(dá)，同時(shí)以轉(zhuǎn)移無義序列的細(xì)胞作為陰性對(duì)照（NC-siRNA）。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞50%～70%融合時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 2000說明書，siRNA和Lipofectamine 2000分別加入250 μL Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋，室溫靜置5 min后輕輕混勻，再將500 μL混合物滴加至6孔板，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。PSAT1-siRNA序列：正義5′-CGC CAAGAAGTTTGGGACTATAT-3′，反義5′-TATAGTCCC AAACTTCTTGGCT-3′。

1.2.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔接種于96孔板，37℃、5%CO2條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)為450 nm的吸光度值，并通過吸光度值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。每組平行設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔接種于6孔板，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至100%融合。用10 μL移液槍頭在細(xì)胞層劃“一”字劃痕，PBS沖洗3遍，再加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移的距離，并計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞用不含血清培養(yǎng)基稀釋，計(jì)數(shù)，配成細(xì)胞懸液；將1×105個(gè)細(xì)胞溶于100 μL DMEM培養(yǎng)液，置于Transwell上室，下室中加入800 μL含有10%FBS的條件培養(yǎng)基。37℃孵育24 h，取出上室，用PBS洗2遍，5%戊二醛4℃固定。加入0.1%結(jié)晶紫染色，室溫染色10 min，PBS洗2次，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下取5個(gè)隨機(jī)視野計(jì)穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.7 Western blot待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，加入RIPA裂解液充分裂解細(xì)胞，提取總蛋白，并利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。30 μg總蛋白用SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，然后加入含有5%脫脂奶粉的TBST液室溫封閉1.5 h，PBS沖洗 2 遍，加入 PSAT1（1:200）、Akt（1:500）、mTOR（1:300）、p-Akt（1:1 000）、p-mTOR（1:1 000）、GAPDH（1:1 000）一抗，4℃孵育過夜。次日PBS沖洗3遍，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗鼠二抗（1:1 000）室溫孵育1h，PBS洗滌后ECL顯影，以GAPDH為內(nèi)參，Image J掃描蛋白灰度值。目的蛋白相對(duì)灰度值=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值，結(jié)果以實(shí)驗(yàn)組相對(duì)灰度值/正常對(duì)照組相對(duì)灰度值表示實(shí)驗(yàn)組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0軟件、GraphPad Prism 7.0軟件和和Adobe Photoshop CS 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖形處理。計(jì)數(shù)資料用百分比表示，χ2檢驗(yàn)分析PSAT1表達(dá)與胰腺癌患者臨床資料的關(guān)系。計(jì)量資料用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較采用Student′st檢驗(yàn)。Kaplan-Meier法繪制胰腺癌患者生存曲線，各組間生存率比較采用Log-rank法；多因素采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織和癌旁組織PSAT1表達(dá)

PSAT1表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞漿，PSAT1在胰腺癌組織中陽性表達(dá)率為69.4%（68/98），明顯高于癌旁組織5.0%（5/98），兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=86.638，P＜0.001，圖1）。

圖1 胰腺癌組織和癌旁組織中PSAT1表達(dá)

2.2 PSAT1表達(dá)與胰腺癌臨床資料的關(guān)系

98例胰腺癌患者中，PSAT1表達(dá)陽性率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、分化程度、腫瘤位置、神經(jīng)侵犯等無關(guān)（P＞0.05，表1）。

表1 PSAT1表達(dá)與胰腺癌臨床資料的關(guān)系 n（%）

表1 PSAT1表達(dá)與胰腺癌臨床資料的關(guān)系 n（%）（續(xù)表1）

2.3 PSAT1表達(dá)與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系

生存分析結(jié)果顯示，PSAT1高表達(dá)的胰腺癌患者總生存期和無病生存期明顯低于PSAT1低表達(dá)患者（P＜0.05，圖2）。Cox多因素回歸顯示，PSAT1表達(dá)是影響胰腺癌總生存的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），PSAT1表達(dá)同時(shí)也是影響胰腺癌無病生存的危險(xiǎn)因素（P＜0.05，表2）。

2.4 抑制PSAT1表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響

由圖3A可見，胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3、PANC1、SW1990中PSAT1蛋白表達(dá)明顯高于AR42J細(xì)胞（P＜0.05）；其中PSAT1蛋白在BxPC-3、SW1990細(xì)胞中表達(dá)最高（2.17±0.18和2.28±0.20），因此選擇BxPC-3、SW1990細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。向BxPC-3、SW1990細(xì)胞轉(zhuǎn)染PSAT1-siRNA后，PSAT1-siRNA組PSAT1蛋白表達(dá)顯著低于NC-siRNA組（P＜0.05，圖3B，3C），說明siRNA可以顯著降低BxPC-3、SW1990細(xì)胞PSAT1表達(dá)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著實(shí)驗(yàn)的延長(zhǎng)，PSAT1-siRNA組細(xì)胞增殖速度減慢，在第72 h和96 h時(shí)，PSAT1-siRNA組細(xì)胞增殖率明顯低于NC-siRNA組（P＜0.05，圖3D，3E），

圖2 不同PSAT1表達(dá)胰腺癌患者總生存曲線和無病生存曲線

表2 Cox多因素分析影響胰腺癌總生存期和無病生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

2.5 抑制PSAT1表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC-siRNA組比較，轉(zhuǎn)染PSAT1-siRNA后BxPC-3、SW1990細(xì)胞相對(duì)遷移距離顯著縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4A，4B）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PSAT1-siRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯低于NC-siRNA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4C，4D）。

圖3 抑制PSAT1表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

圖4 抑制PSAT1表達(dá)降低胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力

2.6 抑制PSAT1表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

本研究利用Western blot檢測(cè)BxPC-3和SW1990細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路重要蛋白：Akt、mTOR蛋白及其活化形式p-Akt、p-mTOR的變化，結(jié)果顯示，與NC-siRNA組相比，PSAT1-siRNA組p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖5）。

圖5 抑制PSAT1表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞Akt、mTOR蛋白表達(dá)的影響

3 討論

代謝變化是腫瘤細(xì)胞典型特征之一，低效能的糖酵解途徑（Warburg效應(yīng)）為腫瘤細(xì)胞提供了大量的碳源，從而滿足腫瘤快速生長(zhǎng)的需要［10］。糖酵解途徑還可以避免產(chǎn)生自由基，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡。因此，在糖酵解過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的代謝酶有望成為腫瘤診療的潛在靶點(diǎn)。PSAT1是磷酸丙酮酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因，在糖酵解中發(fā)揮重要作用。PSAT1是催化磷酸絲氨酸合成的限速酶，通過糖酵解3-磷酸甘油酸酯生成3-磷酸丙酮酸，將糖酵解產(chǎn)物引入絲氨酸合成途經(jīng)，并為細(xì)胞提供原料和能量［11］。Qian等［12］報(bào)道PSAT1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并且與腫瘤細(xì)胞對(duì)伊立替康、5-氟尿嘧啶和亞葉酸鈣的敏感性有關(guān)。Gao等［13］也證實(shí)PSAT1通過調(diào)節(jié)ATF4促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，且高表達(dá)PSAT1與雌激素受體陰性乳腺癌不良預(yù)后有關(guān)。

Song等［14］證實(shí)糖酵解途徑中另外一個(gè)關(guān)鍵酶磷酸甘油酸脫氫酶（PHGDH），與胰腺癌異常增殖和不良預(yù)后有關(guān)?；诖耍茰y(cè)PSAT1可能也參與了胰腺癌的多種生物學(xué)行為。為了驗(yàn)證此假設(shè)，本研究首先利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)胰腺癌組織和癌旁組織PSAT1表達(dá)，結(jié)果顯示PSAT1在胰腺癌組織中陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，同時(shí)胰腺癌細(xì)胞PSAT1表達(dá)也高于胰腺細(xì)胞，說明胰腺癌中PSAT1異常表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)PSAT1與胰腺癌腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，提示PSAT1有作為早期診斷胰腺癌的價(jià)值。Liu等［15］報(bào)道PSAT1表達(dá)升高常提示發(fā)生食管鱗狀細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)升高，并且PSAT1持續(xù)高表達(dá)可以作為患者不良預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。Liao等［16］研究發(fā)現(xiàn)PSAT1表達(dá)與鼻咽癌瘤體體積、TNM分期、分化程度有關(guān)，與PSAT1低表達(dá)者比較，PSAT1高表達(dá)鼻咽癌患者局部無復(fù)發(fā)生存率、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率、疾病特異生存率和總體生存率均顯著縮短。本研究對(duì)胰腺癌患者進(jìn)行隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAT1高表達(dá)的胰腺癌患者總生存期和無病生存期明顯低于PSAT1低表達(dá)患者，PSAT1表達(dá)是胰腺癌總體生存和無病生存的危險(xiǎn)因素。上述結(jié)果說明胰腺癌組織PSAT1表達(dá)與胰腺癌發(fā)生和不良預(yù)后有關(guān)，PSAT1有望成為胰腺癌診斷和預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。

Singh等［17］研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性乳腺癌中PSAT1的高表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)絲氨酸水平呈正相關(guān)，沉默PSAT1表達(dá)可以降低絲氨酸水平，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。本研究利用siRNA技術(shù)沉默胰腺癌BxPC-3、SW1990細(xì)胞PSAT1表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSAT1基因沉默后，胰腺癌細(xì)胞增殖速度明顯減慢，遷移和侵襲能力明顯減弱，說明PSAT1與胰腺癌生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。Hwang等［18］報(bào)道腫瘤細(xì)胞依靠絲氨酸生物合成途經(jīng)為細(xì)胞快速增殖提供原料，抑制PSAT1可以阻斷絲氨酸合成，導(dǎo)致細(xì)胞能量和原料供應(yīng)不足，細(xì)胞分裂周期阻滯，最終引起細(xì)胞凋亡。Yang等［19］證實(shí)PSAT1基因沉默可以使非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1降解，細(xì)胞分裂被阻滯于G0/G1期，最終抑制細(xì)胞增殖。

目前對(duì)PSAT1的研究尚處于起始階段，其對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制仍未闡明。PI3K/Akt/mTOR通路是一條經(jīng)典信號(hào)通路，在調(diào)節(jié)糖原代謝、細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用［20］。研究顯示［21］，激活PI3K/Akt/mTOR通路能顯著提高細(xì)胞的糖酵解水平，而PI3K抑制劑LY294002呈濃度、時(shí)間依賴性的抑制胃癌細(xì)胞增殖。在PI3K/Akt/mTOR通路中，活化的PI3K能激活下游關(guān)鍵蛋白Akt，使Akt作用其底物mTOR作用，完成調(diào)控細(xì)胞代謝、增殖和凋亡等作用［22］。Sharma等［23］報(bào)道胰腺癌細(xì)胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Mitofusin2可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞自噬和線粒體融合。本研究對(duì)轉(zhuǎn)染PSAT1-siRNA的BxPC-3、SW1990細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與NC-siRNA組相比，PSAT1-siRNA組p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)顯著降低，提示沉默PSAT1可以抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活性，PSAT1可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路參與胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述，PSAT1在胰腺癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，PSAT1可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路參與胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。胰腺癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，本研究?jī)H單純觀察了PSAT1的變化，是否同時(shí)存在其他代謝基因改變尚不清楚。另外本組研究的樣本量偏少，特別是分層之后更少，使得在臨床觀察中存在偏倚結(jié)果的可能。接下來的工作中，我們將進(jìn)一步研究PSAT1對(duì)胰腺癌診療的意義以及相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。