青花菜病程相關(guān)蛋白基因BoPR2的克隆與表達(dá)

金魏佳，何 佳，章燕如，范靈希，唐露靜，葉佳燕，鄭 穎，蔣 明

（臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000）

青 花 菜（Brassica oleracea var. italica） 又名西蘭花、綠菜花和綠花椰菜等，為十字花科（Cruciferae）蕓薹屬1年生或2年生草本蔬菜，是甘藍(lán)的一個(gè)變種［1］。青花菜以花球?yàn)橹饕秤貌课?，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含礦質(zhì)元素、碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素及抗癌活性成分蘿卜硫素（Sulforaphane），是一種深受人們喜愛(ài)的保健蔬菜［2-5］。在我國(guó)，隨著青花菜種植面積的不斷擴(kuò)大，病害的發(fā)生日趨嚴(yán)重，根腫病和菌核病已成為青花菜大田生產(chǎn)過(guò)程中的兩種常見(jiàn)病害，每年造成的產(chǎn)量損失十分巨大［5-6］。根腫病由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae）引起，而菌核病由核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）造成，兩種病害在其他蕓薹屬蔬菜中的發(fā)生也十分普遍，是世界性病害［7-8］。我國(guó)不是青花菜的原產(chǎn)地，種質(zhì)資源十分匱乏，而抗病材料更為稀缺，通過(guò)挖掘抗病相關(guān)基因開(kāi)展分子育種是解決種質(zhì)短缺的重要途徑之一，也是解析植物-病原菌互作機(jī)理的基礎(chǔ)和開(kāi)展抗病分子育種的重要前提［9-10］。

病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related protein，PR）是植物體內(nèi)的一類重要蛋白，在病原菌或物理、化學(xué)因子的誘導(dǎo)下表達(dá)或積累，在植物抵御病害及適應(yīng)不良環(huán)境方面發(fā)揮著重要作用［11-12］。根據(jù)氨基酸序列的相似性、酶活性或其他生物學(xué)特性，PR可分為17個(gè)家族，不同類型的PR具有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能［13］。其中PR2具有β-1，3-葡聚糖酶活性，其主要作用是水解β-1，3-葡聚糖，這種糖類物質(zhì)是病原菌細(xì)胞壁的主要成分，因此，PR2的生成與積累能抑制病原菌的生長(zhǎng)和增殖［14-15］。近年來(lái)，已從煙草（Nicotiana tabacum）、番茄（Lycopersicon esculentum） 和 水 稻（Oryza sativa）等植物中克隆到PR2基因，并明確了它們的序列特征和抗病功能［16-18］，但是，有關(guān)PR2在青花菜中的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究以青花菜為材料，在克隆BoPR2基因的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)手段分析序列特征，用實(shí)時(shí)定量PCR明確其在蕓薹根腫菌和核盤菌侵染下的表達(dá)模式，為開(kāi)展基因功能鑒定和抗病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試青花菜材料為Bo0112，栽植于人工氣候箱，在16 h光照/8 h黑暗的光周期下培養(yǎng)，兩葉一心期時(shí)用于病原菌的接種。核盤菌采自浙江臨海上盤青花菜基地，經(jīng)純化后保存于臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。核盤菌接種采用菌絲塊法，對(duì)照用同樣大小的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar, PDA）培養(yǎng)基塊，采集接種0、6、12、24、36、72 h的葉片，用于RNA的提取。蕓薹根腫菌采自溫嶺石橋頭青花菜基地，采用張小麗等［19］的方法接種，對(duì)照用等量的無(wú)菌水，采集接種0、5、10、15、20、25 d的根用于RNA的提取。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA和RNA的提取 基因組DNA的提取采用SDS法［20］，RNA的提取采用Trizol法［21］，經(jīng)電泳鑒定后置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。cDNA的合成采用TaKaRa公司的試劑盒，按其提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2 青花菜BoPR2基因的克隆 用于基因克隆的上、下游引物分別為BoPR2UP：5'-ATGGTACGATTCAAACATAT-3'和BoPR2DN：5'-TTAGTTGAACTTGACACCATATTT-3'，由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司合成，用無(wú)菌ddH2O配制成20 μmol/L備用。分別以DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μL體系中加入以下試劑：10×PCR緩沖液2 μL，20 ng模板DNA或cDNA，0.5 μL 10 m mol/L的dNTPs，0.8 U的Taq DNA聚合酶，上、下游引物各0.1 μL，加ddH2O至終體積。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、51℃退火45 s、72℃延伸45 s，共32個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收、轉(zhuǎn)化和測(cè)序 用無(wú)菌刀片割取含目的條帶的膠塊，采用試劑盒法（上海碧云天生物技術(shù)研究所）回收DNA。取1.5 μL回收產(chǎn)物與p-GEM-Teasy載體（Promega），置于4℃連接，用熱激法導(dǎo)入Trans5α感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。經(jīng)涂布平板，挑取白色單菌落于37℃振蕩培養(yǎng)12 h。用菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆，PCR程序同基因克隆，模板改為0.5 μL菌液，經(jīng)電泳檢測(cè)后取3個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.4 序列分析 利用DNAMAN5.2.2、在線工具SMART（http://smart.embl.de）和Compute PI/Mw（http://web.expasy.org/compute）對(duì) BoPR2基因序列及其編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析［22］。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載甘藍(lán)型油菜（B. Napus，登錄號(hào)：XP_013742178.1）、野甘藍(lán)（B. oleracea var. oleracea， 登 錄 號(hào)：XP_013636025.1）、白 菜（B. rapa subsp.chinensis， 登 錄 號(hào)：BAG68207.1）、蘿卜（Raphanus.sativus，登錄號(hào)：XP_018458775.1）、擬南芥（A. thaliana，登錄號(hào)：ANM63774.1）、玉山筷子芥（A. lyrata subsp.Lyrata，登錄號(hào)：EFH54399.1）、亞麻薺（Camelina sativa，登錄號(hào)：XP_010516340.1）和薺菜（Capsella rubella，登錄號(hào)：EOA24328.1）等8種十字花科植物的PR2序列。用Clustalx 1.81進(jìn)行序列比對(duì)，再利用Mega 3.1構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，構(gòu)建方法為鄰接法（Neighbor-Joining），經(jīng)1 000次自舉檢驗(yàn)［23］。

1.2.5 基因表達(dá)分析 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物，上、下游引物序列分別 為5'-AAGCAGTACAGCATCCCTCG -3'和5'-TGGGAACGTCGAGGATGAAC -3'。表達(dá)采用肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)標(biāo)，上、下游引物分別 為： 5'-ACGTGGACATCAGGAAGGAC-3'和5'-GAACCACCGATCCAGACACT-3'。PCR 反 應(yīng)在Roche Light Cycler 96 PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序：50℃ 5 min，94℃ 30 s；94℃ 5 s、55℃ 15 s、72℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用公式2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoPR2基因的特征

以BoPR2UP和BoPR2DN為引物，分別以青花菜葉片基因組DNA和cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序后得到各自的序列。結(jié)果表明，BoPR2基因組全長(zhǎng)為1 188 bp，包含1個(gè)內(nèi)含子（96 bp），第1與第2外顯子的長(zhǎng)度分別為130 bp和962 bp（圖1）。

圖1 BoPR2基因結(jié)構(gòu)

2.2 BoPR2編碼蛋白的特征

BoPR2編碼351個(gè)氨基酸，經(jīng)Compute pI/Mw tool在線工具預(yù)測(cè)，BoPR2的理論等電點(diǎn)為6.85，分子式為C1740H2663N467O520S15，分子量為38 925 u，不穩(wěn)定指數(shù)為40.48，為不穩(wěn)定蛋白；其總平均親水性系數(shù)為-0.304，BoPR2為親水性蛋白。序列中的天冬酰胺含量最高、達(dá)到8.8%，絲氨酸次之、為8.5%，而半胱氨酸最少、僅0.3%。通過(guò)NCBI的Blast程序分析發(fā)現(xiàn)該蛋白含有1個(gè)保守的Glyco hydro 17結(jié)構(gòu)域，位于+34 ～ +350處（圖2）。

圖2 BoPR2基因的編碼區(qū)及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.3 BoPR2與同源序列的比對(duì)

為研究BoPR2的進(jìn)化地位，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載8種十字花科及其近緣植物的PR序列，用Clustalx 1.81進(jìn)行序列的多重比對(duì)。由圖3（彩插一）可知，9個(gè)PR2蛋白由338～365個(gè)氨基酸殘基組成，其中，野甘藍(lán)的序列最長(zhǎng)、氨基酸殘基數(shù)365個(gè)，甘藍(lán)型油菜次之、為363個(gè)，玉山筷子芥的最短、338個(gè)。序列比對(duì)結(jié)果表明，9種植物PR2的相似性較高，僅個(gè)別氨基酸存在差異，說(shuō)明十字花科植物的PR2在進(jìn)化上十分保守。與BoPR2相比，野甘藍(lán)在+9、+10位有2個(gè)氨基酸殘基的插入，甘藍(lán)型油菜則在+41、+86、+170、+173、+238、+260、+324、+327位存在差異；薺菜與其他同源序列之間的差異較大，在 +1～+15、+152～+153、+173、+247、+317、+341～+343、+360位發(fā)生氨基酸殘基的缺失，在+131、+230、+231位發(fā)生氨基酸殘基的插入。

2.4 BoPR2的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用Mega 3.1構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，構(gòu)建方法為鄰接法。結(jié)果（圖4）表明，8個(gè)不同物種的PR2在進(jìn)化樹(shù)上可分為5組。其中，青花菜與同為蕓薹屬的野甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜和白菜的遺傳距離最小，它們之間的親緣關(guān)系最近，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚于I組；同為擬南芥屬的擬南芥和玉山筷子芥PR2之間的遺傳距離最近，它們?cè)谶M(jìn)化樹(shù)上處于同一組（Ⅴ）；蘿卜、薺菜、亞麻薺均單獨(dú)成組，分別為II、III、IV組。

圖4 BoPR2及其同源序列的進(jìn)化樹(shù)

2.5 BoPR2的表達(dá)分析

為研究病原菌脅迫對(duì)青花菜BoPR2表達(dá)的影響，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)表達(dá)水平。結(jié)果（圖5）表明，核盤菌不能誘導(dǎo)BoPR2的表達(dá)，在侵染0～72 h期間，表達(dá)量未見(jiàn)顯著變化（圖5A）；在蕓薹根腫菌的誘導(dǎo)下，BoPR2的表達(dá)量逐漸增加，在10 d時(shí)的相對(duì)表達(dá)量最大，約為對(duì)照的6倍，隨后逐漸降低，在15 d和20 d時(shí)的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的3.60、3.22倍（圖5B）。

圖5 青花菜BoPR2基因的表達(dá)

3 結(jié)論與討論

植物PR2是一類重要的病程相關(guān)蛋白，在生長(zhǎng)發(fā)育及抵御病原菌、昆蟲(chóng)和非生物脅迫等方面起著重要作用［24-25］。PR蛋白可分為17類，其中PR1的功能未知，PR2編碼β-1,3-葡聚糖酶，PR3、PR4、PR8和PR11則編碼幾丁質(zhì)酶［26］。已從多種植物中克隆到PR2基因，大豆（Glycine max）GmBG1基因編碼347個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為8.71［14］；海島棉（Gossypium barbadense）GbGLU基因的全長(zhǎng)為1 086 bp，編碼361個(gè)氨基酸，分子量為 39.66 ku［27］；小麥（Triticum aestivum）TcLr19PR2基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 005 bp，編碼334個(gè)氨基酸［28］。本研究從青花菜中克隆到1個(gè)PR2基因，定名為BoPR2。該基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 092 bp，編碼351個(gè)氨基酸，BoPR2與野甘藍(lán)PR2的相似度最高，僅存在2個(gè)氨基酸殘基的差異，而與同屬的甘藍(lán)型油菜、青菜的序列差異稍大，在進(jìn)化樹(shù)上處于相鄰的分枝，這與蕓薹屬植物的分類結(jié)果一致。BoPR2編碼區(qū)的大小與芥菜（B. juncea）PR2相仿，芥菜BjPR2的編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 020 bp，編碼339個(gè)氨基酸［29］。

在正常環(huán)境條件下，植物體內(nèi)的PR2含量較少，活性很低，但經(jīng)病原菌侵染后，PR2的積累量顯著增加，表明PR2與植物抵御病害有關(guān)［30］。大豆GmBG1基因的表達(dá)受腐霉菌（Pythium ultimum）誘導(dǎo)，在抗病材料中表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在24 h時(shí)達(dá)到最大值［14］；海島棉GbGLU基因受黃萎病菌（Verticillium dahliae）的誘導(dǎo)，在接種48 h時(shí)表達(dá)量開(kāi)始升高，96 h時(shí)達(dá)到最大值［27］；半定量RT-PCR結(jié)果表明，該基因受小麥葉銹菌（Puccinia triticina）的誘導(dǎo)，表達(dá)量在48 h達(dá)到最大值［28］。蕓薹根腫菌是活體寄生菌，可激活植物的水楊酸信號(hào)途徑，而核盤菌為腐生營(yíng)養(yǎng)菌，它激活寄主的茉莉酸/乙烯信號(hào)途徑，而PR2是水楊酸信號(hào)途徑的一個(gè)標(biāo)志基因［31］。本研究中，在蕓薹根腫菌的誘導(dǎo)下，青花菜BoPR2的表達(dá)量逐漸增加，在10 d時(shí)的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的6倍，但是，BoPR2基因的表達(dá)并不受核盤菌的誘導(dǎo)。在黑斑病菌（Alternaria brassicae）侵染下，芥菜BjPR2的表達(dá)量也呈先上升后下降的趨勢(shì)，在24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值［29］。

本研究以青花菜為材料，克隆得到1個(gè)PR2基因，并明確了其序列特征和表達(dá)特點(diǎn)，該基因的表達(dá)受蕓薹根腫菌的誘導(dǎo)。下一步，將利用遺傳轉(zhuǎn)化方式研究該BoPR2在抗病反應(yīng)中的功能。