不同植物類型復(fù)合垂直流人工濕地根系微生物群落結(jié)構(gòu)的研究

蔣旭瑤，吉喜燕，黃德英，張繼彪

（1.復(fù)旦大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系，上海 200433；2.復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系，上海 200433）

近年來，人工濕地由于其造價(jià)低、便于維修管理、處理效率高、觀賞性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于污水處理中[1-2]。然而，濕地在凈化水質(zhì)的同時(shí)會(huì)釋放大量溫室氣體，越來越受到廣泛關(guān)注[3]。微生物和植物是人工濕地的重要組成部分，其污水處理能力取決于濕地設(shè)計(jì)、微生物群落和植物種類等[4]。微生物在濕地生物地球化學(xué)循環(huán)中起著重要作用；不同的微生物群落會(huì)產(chǎn)生不同的生物化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)鹽的消耗[5-6]。因此，濕地植物根系微生物群落結(jié)構(gòu)的研究有助于改進(jìn)人工濕地的設(shè)計(jì)以及管理，提高濕地水質(zhì)凈化能力，并對(duì)濕地溫室氣體排放的控制提供理論依據(jù)[7]。濕地中微生物的硝化、反硝化作用是去除氮的主要途徑，硝化、反硝化細(xì)菌是反應(yīng)的主要執(zhí)行者[8]。因此，對(duì)濕地中硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌展開分析有助于濕地污水脫氮機(jī)制的研究。

過去，人們針對(duì)濕地微生物種群的研究一直建立在傳統(tǒng)的分離和培養(yǎng)方法上，這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，培養(yǎng)的種群數(shù)量也有限[9]。目前，關(guān)于濕地土壤微生物的研究大多運(yùn)用傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)，如PCR-DG?GE和FISH[10]。PCR-DGGE技術(shù)是將PCR擴(kuò)增和變性梯度凝膠電泳結(jié)合起來，可對(duì)同一長(zhǎng)度的PCR擴(kuò)增片斷按序列的不同在變性梯度凝膠上分離，在分析微生物群落多樣性方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但是它只適用于微生物比較豐富的樣本[10]。FISH技術(shù)是根據(jù)已知微生物不同分類級(jí)別上種群特異的DNA序列，以熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境基因組中DNA分子雜交，該技術(shù)可以進(jìn)行樣品原位雜交，但受引物以及試樣不合適的限制[10]。高通量DNA測(cè)序是一種測(cè)序深度較深、覆蓋度較廣的方法，該技術(shù)通過大量平行序列產(chǎn)生大量DNA數(shù)據(jù)，其中的可操作性分類單元（OTUs）可用于有效分析樣本中微生物的多樣性[10]。

本研究選擇美人蕉、菖蒲和水蔥三種典型的濕地植物，通過構(gòu)建復(fù)合垂直流人工濕地研究不同季節(jié)、上行池和下行池土壤根際微生物群落結(jié)構(gòu)的變化特征，分析根系微生物結(jié)構(gòu)和功能的對(duì)應(yīng)關(guān)系，旨在為人工濕地的改進(jìn)和優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)系統(tǒng)

復(fù)合垂直流人工濕地系統(tǒng)位于復(fù)旦大學(xué)邯鄲校區(qū)研究基地，在自然光照下的露天大棚內(nèi)運(yùn)行，示意圖如圖1所示。每個(gè)系統(tǒng)由上、下行池組成，尺寸為150 cm×90 cm×90 cm（長(zhǎng)×寬×高），下行池內(nèi)基質(zhì)自下而上分別為20 cm礫石（?30～50 mm）、20 cm礫石（? 10～20 mm）、20 cm細(xì)砂和10 cm土壤；上行池自下而上分別為20 cm礫石（?30～50 mm）、20 cm礫石（?10～20 mm）、10 cm細(xì)砂和10 cm土壤。每個(gè)系統(tǒng)種植一種植物，分別為菖蒲、美人蕉和水蔥，每平方米分別種植20棵、20棵和20簇。模擬生活污水從濕地下行池上端流入，從上行池上端流出。模擬生活污水主要是往自來水中加入葡萄糖、淀粉、魚粉蛋白胨、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂等。進(jìn)水水質(zhì)總有機(jī)碳、銨態(tài)氮、總氮和總磷的濃度分別為68～84、20～28、50～59 mg·L-1和4～6 mg·L-1。進(jìn)水采用間歇流的方式，一周配一次1000 L污水，污水放置在一個(gè)1000 L的塑料桶中，水力負(fù)荷為330 mm·d-1，停留時(shí)間為5 d。系統(tǒng)從2015年6月開始運(yùn)行，到2017年5月份結(jié)束，運(yùn)行穩(wěn)定，植物長(zhǎng)勢(shì)良好。

圖1 復(fù)合垂直流人工濕地系統(tǒng)示意圖Figure 1 Picture of integrated vertical flow constructed wetland

1.2 樣品采集

本試驗(yàn)于2016年7月、10月和2017年1月用五點(diǎn)采樣法分別采集三種植物濕地系統(tǒng)的上行池、下行池10 cm處根系土壤。樣品標(biāo)記為：ACL表示菖蒲，CIL表示美人蕉，SVV表示水蔥；7、10、1表示月份；D表示下行池，U表示上行池。樣品名稱分別為：ACL7D、ACL7U、CIL7D、CIL7U、SVV7D、SVV7U、ACL10D、 ACL10U、 CIL10D、 CIL10U、 SVV10D、SVV10U、ACL1D、ACL1U、CIL1D、CIL1U、SVV1D、SVV1U。

1.3 DNA提取

采用Omega E.Z.N.A.?Soil DNA Kit提取試劑盒提取根系土壤DNA，按說明書完成相關(guān)操作，然后將提取好的DNA保存在-20℃。

1.4 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

本實(shí)驗(yàn)采用引物520F（5′-barcode+GCACCTA?AYTGGGYDTAAAGNG-3′）和 802R（5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′）[11]，擴(kuò)增長(zhǎng)度約為 280 bp的 16S rRNA V4區(qū)用來測(cè)序。

PCR采用NEB Q5 DNA高保真聚合酶，各組成及用量如下：0.25 μLQ5 high-fidelity DNA polymerase，5 μL 5*Reaction Buffer，5 μL 5*High GC Buffer，0.5 μL dNTP（10 mmol·L-1），1 μL模板 DNA，1 μL 正向引物（10 μmol·L-1），1 μL反向引物（10 μmol·L-1）和11.25 μL水。PCR擴(kuò)增程序如下：將PCR反應(yīng)所需的成分配制完后，在PCR儀上于98℃預(yù)變性30 s，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中，先于98℃保持15 s使模板變性，然后將溫度降到50℃，保持30 s，使引物與模板充分退火；在72℃保持30 s，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個(gè)循環(huán)。重復(fù)這樣的循環(huán)25～27次，使擴(kuò)增的DNA片段大量累積。最后，在72℃保持5 min，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存。

利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Li?brary Prep Kit進(jìn)行建庫(kù)；在MiSeq機(jī)器上進(jìn)行MiSeq Reagent Kit V3（600 cycles）2×300 bp的雙端測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對(duì)樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析時(shí)，在90%的最低測(cè)序深度水平，采取對(duì)OTU豐度矩陣中全體樣本進(jìn)行隨機(jī)重復(fù)抽樣，并使用Chao1指數(shù)來表示群落豐富度。樣品進(jìn)行Beta多樣性分析時(shí)，對(duì)Unweighted Uni?Frac距離矩陣和Weighted UniFrac距離矩陣進(jìn)行NMDS分析，用于描述群落樣本的結(jié)構(gòu)分布。

2 結(jié)果與討論

圖2 樣品的稀疏曲線Figure 2 The rarefaction curves for samples

樣品的稀疏曲線如圖2所示，所有樣品測(cè)序量在5260時(shí)，曲線已趨于平緩或者達(dá)到平臺(tái)期，因此可以認(rèn)為測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。

三種植物濕地微生物多樣性指數(shù)如圖3所示。水蔥濕地在實(shí)驗(yàn)期間，上行池與下行池的物種豐富度差異不大。除10月份美人蕉濕地下行池Chao1指數(shù)小于上行池Chao1指數(shù)外，菖蒲濕地與美人蕉濕地表現(xiàn)為其下行池的豐富度大于上行池。這是因?yàn)橄滦谐貫槲鬯斎攵?，營(yíng)養(yǎng)鹽含量較高，適宜微生物代謝繁殖。流入上行池的污水經(jīng)過下行池的降解處理，能被微生物利用的營(yíng)養(yǎng)鹽降低，導(dǎo)致微生物豐富度下降。

圖3 三種植物濕地微生物多樣性指數(shù)Figure 3 Diversity indices of microbes in three plant wetlands

本研究用NMDS分析（Nonmetric Multidimension?al Scaling），通過降維處理簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，在特定距離尺度下描述樣本分布特征。圖4a為Unweighted Uni?Frac NMDS分析的樣本二維排序圖。除ACL7U樣品，樣本組均勻分布在坐標(biāo)上下兩側(cè)，表明在試驗(yàn)期間上行池和下行池樣本組群落成員相似，但是兩者群落成員組成之間有差異，存在各自獨(dú)有的微生物。這可能是因?yàn)橄滦谐叵牧舜罅垦鯕?，?dǎo)致上行池氧氣較低，使得下行池中有氧細(xì)菌遠(yuǎn)多于上行池中有氧細(xì)菌數(shù)[12]。

由圖4b可知，除ACL7U樣品，上行池樣品組靠的較近，表明從群落成員豐度上來看，上行池樣本相似性較下行池樣本相似性高，這主要是因?yàn)橄滦谐厥俏鬯畠艋闹饕獔?chǎng)所，下行池的營(yíng)養(yǎng)鹽含量和溶解氧含量等相關(guān)影響因素沿程變化梯度較大，造成微生物生存環(huán)境變化較大，三種植物濕地在不同環(huán)境影響下形成了差異略大的生態(tài)系統(tǒng)。而經(jīng)過下行池的水流，其中的污染物濃度已經(jīng)較低，其濃度、溶解氧等變化較為平緩，導(dǎo)致微生物所處環(huán)境較為相似[13]，因此上行池樣品組相似性高于下行池。

圖4 Unweighted UniFrac NMDS分析的樣本二維排序圖（a）和Weighted UniFrac NMDS分析的樣本二維排序圖（b）Figure 4 Unweighted UniFrac NMDS analysis of samples in two dimensions（a）and Weighted UniFrac NMDS analysis of samples in two dimensions（b）

門和屬水平上微生物群落組成及豐度如圖5所示，在菖蒲濕地中（圖5左側(cè)a），主要的微生物有變形菌門（Proteobacteria，38.4%）、酸桿菌門（Acidobacteria，16.9%）、綠彎菌門（Chloroflexi，13.1%）。變形菌門所占比例較大，這與已有研究一致[14-15]。酸桿菌門相對(duì)豐度在菖蒲濕地下行池夏秋冬季節(jié)、上行池夏秋冬季節(jié)占有較大比例，分別為15.6%、15.8%、17.0%、17.2%、16.5%、19.5%。綠彎菌門的相對(duì)豐度在菖蒲下行池夏秋冬季節(jié)、上行池夏秋冬季節(jié)分別占14.5%、11.7%、11.2%、11.0%、16.5%、13.8%。

美人蕉濕地的微生物群落結(jié)果如圖5左側(cè)b所示，下行池根系的變形菌門相對(duì)豐度在秋季最大，達(dá)到50.9%；上行池根系變形菌門相對(duì)豐度在夏季、秋季和冬季差異不大，維持在33.0%到34.2%之間?？傮w來說，下行池變形菌門相對(duì)豐度高于上行池。酸桿菌門在下行池、上行池的相對(duì)豐度夏季最高，分別為20.4%、18.7%，且下行池酸桿菌門相對(duì)豐度高于上行池。綠彎菌門下行池夏季較高，達(dá)到14.4%，上行池秋季較高，達(dá)到16.6%。

水蔥濕地根系微生物主要類別同為變形菌門（34.6%）、酸桿菌門（17.5%）、綠彎菌門（10.8%）（圖5左側(cè)c）。隨季節(jié)演替，變形菌門在下行池的相對(duì)豐度從46.3%降到31.1%。上行池相對(duì)豐度隨季節(jié)變化不明顯，基本維持在30.0%。下行池酸桿菌門的相對(duì)豐度夏季＞秋季＞冬季，分別為17.0%、16.1%、10.7%，上行池秋季＞夏季＞冬季，分別為21.7%、20.0%、19.6%。綠彎菌門下行池秋季＞夏季＞冬季，分別為13.0%、9.4%、6.8%。

三種濕地植物根系微生物組成在門水平上相似，主要有變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門等。變形菌門比例較高，包含許多微生物都與碳、氮、硫循環(huán)相關(guān)[16]，在去除碳、氮方面有重要的作用，同時(shí)對(duì)溫室氣體的生成有巨大影響。酸桿菌門是嚴(yán)格厭氧細(xì)菌，用來發(fā)酵芳香族混合物和醋酸鹽[17]。綠彎菌門在營(yíng)養(yǎng)鹽的去除過程中發(fā)揮著重要作用[18]。同時(shí)濕地中還檢測(cè)到了浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、泉古菌門（Crenarchaeota）、厚壁菌門（Firmicutes）等。浮霉菌門能將NO-2作為電子受體，將氨轉(zhuǎn)化為氮?dú)?，?duì)NH3-N的去除有重要影響[19]。芽單胞菌門中的一些菌種已被確認(rèn)為革蘭氏陰性、好氧、積累磷酸鹽微生物[20]。放線菌門將氫氣作為電子供體用來去除硝酸鹽，對(duì)生成N2O有重要影響。疣微菌門相對(duì)豐度為0.8%，能氧化CH4，對(duì)其排放有抑制作用[21]。

圖5 門和屬水平上微生物群落在樣本中組成及豐度Figure 5 Taxonomic composition at phylum and genus level and abundance of microbes in each sample

屬水平上的微生物群落組成及相對(duì)豐度如圖5右側(cè)圖所示，三種濕地根系中主要的微生物屬有Ni?trospira、Candidatus Nitrosophaera等。其中，Nitrospira是硝化細(xì)菌；Candidatus Nitrosophaera是亞硝化細(xì)菌。不同植物濕地優(yōu)勢(shì)菌屬有類似，也有差異。硝化細(xì)菌最主要的微生物屬為Nitrospira，下行池在秋季達(dá)到最高，相對(duì)豐度為2.44%。

菖蒲濕地在屬水平上的硝化、反硝化細(xì)菌組成及其相對(duì)豐度如表1所示。Nitrospira和Candidatus Ni?trosophaera是主要的硝化細(xì)菌，下行池、上行池相對(duì)豐度均在秋季達(dá)到最高，分別為6.64%、4.33%。反硝化微生物有Dechloromonas、Flavobacterium、Pseudomo?nas屬等，這與已有研究結(jié)果一致[22-25]。菖蒲下行池的根系反硝化微生物在夏季所占比例最多，約1.34%，秋季與冬季差異不明顯，上行池反硝化細(xì)菌相對(duì)豐度隨季節(jié)變化不明顯，基本維持在0.62%～0.78%。下行池反硝化微生物相對(duì)豐度高于上行池。下行池硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌相對(duì)豐度都比上行池高，這可能是因?yàn)橄滦谐厥沁M(jìn)水端，含有豐富的氮源、碳源供微生物生長(zhǎng)活動(dòng)[13]。

在美人蕉濕地中，下行池植物根系的硝化細(xì)菌Nitrospira和Candidatus Nitrosophaera相對(duì)豐度在夏季達(dá)到最高3.60%，上行池秋季達(dá)到最高3.62%（表2）。反硝化細(xì)菌主要有Dechloromonas、Flavobacterium、Pseudomonas等。下行池和上行池根系反硝化細(xì)菌相對(duì)豐度分別在秋季和夏季達(dá)到最高，分別為2.30%和0.98%。

表1 菖蒲濕地硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌的相對(duì)豐度表（%）Table 1 The relative abundance of nitrifying bacteria and denitrifying bacteria in ACL cell（%）

表2 美人蕉濕地硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌的相對(duì)豐度表（%）Table 2 The relative abundance of nitrifying bacteria and denitrifying bacteria in CIL cell（%）

在水蔥濕地中，硝化細(xì)菌為Nitrospira和Candida?tus Nitrosophaera（表3），上、下行池的相對(duì)豐度在秋季達(dá)到最高，分別占4.16%、4.78%。反硝化細(xì)菌有De?chloromonas、Flavobacterium、Pseudomonas等，下行池反硝化細(xì)菌相對(duì)豐度在秋季達(dá)到最高，為1.51%；上行池冬季達(dá)到最高，為1.55%。

總之，濕地植物根系硝化細(xì)菌屬為Nitrospira、Candidatus Nitrosophaera，反硝化細(xì)菌屬為Dechlo?romonas、Flavobacterium、Pseudomonas等。菖蒲和水蔥濕地秋季硝化細(xì)菌豐度均高于夏季和冬季。

3 結(jié)論

（1）菖蒲濕地、美人蕉濕地和水蔥濕地系統(tǒng)Chao1指數(shù)均表現(xiàn)為秋季＞夏季＞冬季，即微生物豐富度秋季＞夏季＞冬季。水蔥濕地上行池與下行池物種豐富度差異不大；除秋季的美人蕉濕地，菖蒲濕地與美人蕉濕地Chao1指數(shù)表現(xiàn)為下行池＞上行池。

（2）在試驗(yàn)期間，各濕地上行池和下行池樣本組群落組成均相似；但上、下行池群落成員組成之間有差異，上行池樣本相似性較下行池樣本高。

（3）門水平上，濕地根系微生物從大到小依次為變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門等。從屬水平上，檢測(cè)到了硝化細(xì)菌Nitrospira和Candidatus Nitrosophaera；反硝化細(xì)菌Dechloromonas、Flavobacterium和Pseudo?monas等。菖蒲濕地和水蔥濕地根系硝化細(xì)菌秋季的相對(duì)豐度均高于夏季和冬季。

表3 水蔥濕地硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌的相對(duì)豐度表（%）Table 3 The relative abundance of nitrifying bacteria and denitrifying bacteria in SVV cell（%）