DNA-SIP鑒定甘蔗//大豆間作土壤15N-DNA富集位置的氮循環(huán)功能基因qPCR方法

茍永剛 ，余玲玲 ，許 霞 ，王建武 *

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶亞熱帶生態(tài)研究所，廣州 510642；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院生態(tài)學(xué)系，廣州 510642）

農(nóng)田間作系統(tǒng)氮素循環(huán)是國際、國內(nèi)研究的熱點(diǎn)問題，但目前的研究僅停留在間作作物氮素固定與轉(zhuǎn)移等表觀指標(biāo)計(jì)算上[1-6]，尚未深入到土壤微生物所驅(qū)動(dòng)的生物固氮作用、氨化作用、硝化作用、反硝化作用等主要氮素循環(huán)過程[7]，如何從復(fù)雜的土壤總微生物群落中分離出直接參與氮素循環(huán)的核心微生物及相關(guān)功能基因是亟待解決的問題。穩(wěn)定性同位素核酸探針技術(shù) DNA-SIP（DNA-based stable isotope prob?ing）是采用穩(wěn)定同位素示蹤復(fù)雜環(huán)境中微生物基因組DNA的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)[8-9]，利用13C或15N等穩(wěn)定同位素示蹤同化了標(biāo)記底物的微生物作用者，將特定的物質(zhì)代謝過程與微生物群落物種組成直接耦合，從而在群落水平上揭示間作系統(tǒng)下直接參與土壤氮、碳轉(zhuǎn)化的核心功能微生物及其生理代謝的關(guān)鍵過程[10-12]。DNA-SIP技術(shù)的發(fā)展為農(nóng)田間作系統(tǒng)中氮素循環(huán)的研究提供了新思路，可以利用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記目標(biāo)作物，進(jìn)一步示蹤并分離參與氮素循環(huán)相關(guān)的核心微生物，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)深入分析其物種分布及生理代謝機(jī)制。

采用植物原位注射標(biāo)記的方法可以直接示蹤間作系統(tǒng)中氮素的流向，能夠清楚地標(biāo)記并分離參與氮素循環(huán)的核心微生物，是研究甘蔗//大豆間作系統(tǒng)土壤氮素循環(huán)的有效方法。目前DNA-SIP技術(shù)的研究中絕大多數(shù)采用13C標(biāo)記底物培養(yǎng)環(huán)境樣品來探索碳的循環(huán)和利用情況[13-16]，尚未見15N原位標(biāo)記探索甘蔗//大豆間作系統(tǒng)土壤氮素循環(huán)的研究報(bào)道。DNASIP技術(shù)的核心是超高速密度梯度離心分離穩(wěn)定性同位素標(biāo)記和非標(biāo)記的DNA，如何鑒定超高速密度梯度離心后15N-DNA的富集位置是應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵。應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR是鑒別超高速離心后標(biāo)記DNA富集位置的最可靠技術(shù)之一[9]。本文通過室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，采用15N-DNA-SIP技術(shù)分離甘蔗//大豆間作系統(tǒng)中大豆根際土壤微生物總DNA，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)6個(gè)氮素循環(huán)關(guān)鍵功能基因在不同CsCl浮力密度層級(jí)中的基因豐度分布鑒定15NDNA的富集位置，通過比較鑒定效果，篩選出有效鑒定甘蔗//大豆間作系統(tǒng)DNA-SIP中超高速離心后15NDNA富集位置的指示功能基因，旨在為甘蔗//大豆間作系統(tǒng)氮素循環(huán)的研究提供一種新的技術(shù)方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試甘蔗品種為“粵糖 00-236”（Saccharum si?nensis Roxb.cv.Yuetang 00-236），大豆品種為“上海青”（Glycine max L.cv.Shanghaiqing）。供試土壤取自于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)（23°8′N，113°15′E）試驗(yàn)田的長期定位試驗(yàn)小區(qū)，土壤類型為赤紅壤，pH為5.90，有機(jī)質(zhì)含量 12.57 g·kg-1，堿解氮 58.25 mg·kg-1，速效磷81.10 mg·kg-1，速效鉀27.98 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置兩種不同的根系隔離模式，第一種模式是將甘蔗和大豆的根系完全隔離，作物根系之間沒有任何物質(zhì)交換；第二種模式是甘蔗和大豆之間根系無隔離，作物根系之間物質(zhì)可以自由完全交換。甘蔗和大豆之間根系無隔離的可視為甘蔗//大豆間作，完全隔離的甘蔗和大豆可視為單作甘蔗和單作大豆。使用（15NH4）2SO4分別標(biāo)記完全分隔和無隔離盆栽大豆，甘蔗不做標(biāo)記，以未標(biāo)記單作大豆為參比對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。試驗(yàn)種植模式如圖1所示。試驗(yàn)所用塑料盆規(guī)格為33.3 cm×22.3 cm×13.0 cm，完全分隔盆子中間使用3 mm厚塑料隔板沿寬度方向分隔為兩室，每小室規(guī)格為33.3 cm×11.0 cm×13.0 cm，每個(gè)盆子底部打16個(gè)直徑為4 mm的小孔以利于透氣排水。

本試驗(yàn)于2017年7月27日至9月13日在廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)農(nóng)場(chǎng)溫室內(nèi)進(jìn)行。土壤過2 mm篩，按體積比摻20%的小石子（Φ3～6 mm，121℃滅菌30 min），每盆裝混勻后的土壤10 kg。每盆移栽甘蔗2株，大豆5株。植物生長期間每日定量澆水，保持土壤濕度在40%～65%之間，溫度控制在25～30℃之間，每隔7 d調(diào)換一次盆子位置。

1.3 作物15N同位素標(biāo)記

圖1 根系隔離15N標(biāo)記盆栽試驗(yàn)?zāi)Ｊ綀D[17]Figure1 Schematicdiagramof15Nlabelandrootseparationin pots[17]

本試驗(yàn)采用15N溶液葉柄注射的方法標(biāo)記[18-19]。將15N豐度為99.14%的（15NH4）2SO（4上海化工研究院生產(chǎn)）配制成濃度為88 mmol·L-1的稀溶液，大豆始花期（R1，35 d）開始標(biāo)記，每日使用10 μL的微量進(jìn)樣器（上海安亭微量進(jìn)樣器廠，上海）從大豆的葉柄或莖中注射10 μL的15N標(biāo)記溶液，連續(xù)注射9 d，共注射90 μL的（15NH4）2SO4溶液。最后一次標(biāo)記后6 d收獲取樣。

1.4 樣品15N同位素豐度測(cè)定

收獲時(shí)將甘蔗、大豆植株分為地上部和根兩部分裝于牛皮紙袋105℃下殺青30 min，70℃烘至恒量，用高速萬用粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司，中國）磨碎，過0.18 mm篩；收集大豆根圍土，室溫風(fēng)干后用研缽磨碎，過0.18 mm篩。采用同位素比值質(zhì)譜儀（IRMS）Thermo Scientific Delta V Advantage（Thermo Fisher Scientific Inc.，美國）測(cè)定植物和土壤樣品15N同位素豐度。

1.5 根際土微生物總DNA提取

收獲時(shí)用滅菌毛刷輕輕刷取緊貼于大豆根（≤2 mm）的土作為大豆根際土。采用PowerMaxRSoil DNA Isolation Kit 12988-10（MoBio Laboratories Inc.，Carlsbad，CA，USA）提取大豆根際土中微生物DNA。洗脫后分裝3 μL用于檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，其他部分DNA存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

使用NanoDropTM2000c微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific，DK）對(duì)所提取的DNA濃度和純度進(jìn)行測(cè)定，當(dāng) A260/A280處于 1.8～2.0，A260/A230處于 2.0～2.2時(shí)可認(rèn)為目標(biāo)DNA樣品純度較好，可用于下游試驗(yàn)。

1.6 超高速密度梯度離心

1.6.1 DNA-CsCl溶液制備

參考Neufeld等[21]的方法，取適量CsC（lAR）溶于pH=8.0的TE溶液，通過AR200 Digita（lReichert，Inc.，Buffalo，NY，USA）手持折光儀測(cè)定折光率，將溶液浮力密度調(diào)節(jié)至1.780～1.800 g·mL-1之間作為母液，取適量母液加入TE，將浮力密度調(diào)節(jié)為1.728 g·mL-1作為補(bǔ)充液。

折光率與浮力密度的關(guān)系如下：

式中：BD為溶液浮力密度；RI為溶液折光率[22]。

將6 μg大豆根際土DNA樣品，配制成浮力密度為1.728 g·mL-1的DNA-CsCl離心液。用5 mL的無針注射器將調(diào)配好的DNA-CsCl離心液轉(zhuǎn)移至超高速離心試管（Reorder no.344058，Beckman Coulter，Inc.USA）中，使用浮力密度為1.728 g·mL-1的CsCl溶液盡可能充滿離心試管且無氣泡產(chǎn)生，以防止超高速離心過程中試管爆裂，將兩個(gè)對(duì)稱位置離心試管稱質(zhì)量配平，使其質(zhì)量之差小于±0.01 g，隨后用熱封儀（Beck?man Coulter，cat.no.349646）將離心管封好，確保不漏液。

1.6.2 等密度梯度超高速離心

本試驗(yàn)選用20℃，178 000×g離心力條件下離心48 h，使用Optima L-100 XP超速離心機(jī)（Beckman Coulter Incorporated，Brea，CA，USA），NVT 100離心轉(zhuǎn)子（Beckman Coulter Incorporated，Brea，CA，USA）。

1.7 不同浮力密度DNA分層與純化

將離心液均等分為20層到2 mL離心管，每管體積 約 為 280 μL，對(duì) 每 層 溶 液 用 AR200 Digital（Reichert，Inc.，Buffalo，NY，USA）手持折光儀測(cè)定RI值，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，DNA離心后處于RI為1.400 0～1.404 0的浮力密度層級(jí)，因此保存該層級(jí)的DNA離心液做進(jìn)一步DNA純化。純化所用試劑為EZNA Mi?croElute DNA clean-up kit純化試劑盒（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，USA）。

1.8 功能基因qPCR引物選擇

本試驗(yàn)選擇檢測(cè)調(diào)控固氮過程（nifH）、有機(jī)氮礦化過程（chiA）、硝化過程（amoA）和反硝化過程（nirK、nirS和nosZ）的關(guān)鍵基因，引物信息及反應(yīng)程序如表1。

反應(yīng)結(jié)束后添加溶解曲線程序（95℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，30 s；60 ℃，15 s）。

1.9 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

1.9.1 功能基因片段的擴(kuò)增

以對(duì)照組大豆根際土DNA為模板，分別用6對(duì)引物進(jìn)行相應(yīng)功能基因片段擴(kuò)增。采用Recombinant Taq DNA Polymerase（TaKaRa Bio Inc.）在 Bio-Rad S1000 PCR系統(tǒng)（Bio-Rad，F(xiàn)oster，CA，USA）擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL：2.5 μL 10×PCR Buffer，2.5 μL dN TP MIX，1 μL DNA 模板，引物上游和下游各 1 μL，ddH2O 16.8 μL，Taq 酶 0.2 μL。PCR 反 應(yīng)程序 為：95 ℃，30 min→35 ×（95 ℃，30 s；Tm；72 ℃，90 s）→72℃，10 min，退火溫度按照表1中相應(yīng)引物Tm設(shè)定。反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，在紫外燈下對(duì)目標(biāo)條帶切膠，使用TaKaRa Mini?BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（TaKaRa Bio Inc.）膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。

1.9.2 載體連接轉(zhuǎn)化

表1 qPCR引物及反應(yīng)程序Table 1 Primers and qPCR conditions used in the experiment

使用 pMDTM18-T Vector Cloning Kit（TaKaRa Bio Inc.）試劑盒將回收純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18載體連接，連接反應(yīng)體系為：1 μL pMD18-T Vector，純化DNA 4 μL，SolutionⅠ 5 μL，總體積10 μL。

1.9.3 質(zhì)粒提取及其拷貝數(shù)計(jì)算

使用MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0（TaKaRa Bio Inc.）質(zhì)粒純化試劑盒對(duì)菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取與純化。使用NanoDropTM2000c微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific，DK）測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度和純度，按照如下公式[30]計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)：

質(zhì)?？截悢?shù)（copies·μL-1）=6.02×1023（copies·mol-1）×質(zhì)粒濃度（g·μL-1）/質(zhì)粒分子量（g·mol-1）

1.1 0 qPCR分析功能基因豐度分布

以等密度梯度超高速離心分層、純化后的DNA為模板，使用 SYBRRPremix Ex TaqTMII（TaKaRa Bi?otechnology，Otsu，Shiga，Japan）Real Time PCR的專用試劑盒在Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific Inc.UK）上進(jìn)行絕對(duì)定量PCR分析，檢測(cè)各功能基因在不同浮力密度層級(jí)的拷貝數(shù)。為了準(zhǔn)確比對(duì)各處理不同浮力密度層級(jí)DNA中功能基因拷貝數(shù)，進(jìn)行qPCR操作時(shí)，對(duì)15N標(biāo)記大豆單作、15N標(biāo)記大豆//甘蔗間作以及不含15N標(biāo)記的大豆單作對(duì)照組中各浮力密度層級(jí)DNA在96孔PCR板上同步進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)樣品3次重復(fù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線使對(duì)應(yīng)功能基因的克隆重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋，8個(gè)稀釋梯度，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，選用無菌去離子水作為陰性對(duì)照，按照表1設(shè)置擴(kuò)增程序，擴(kuò)增體系如表2。待PCR結(jié)束后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度計(jì)算出樣品中的基因拷貝數(shù)。最終呈現(xiàn)數(shù)據(jù)使用基因相對(duì)豐度表示，即相同處理中各層級(jí)DNA基因拷貝數(shù)與所有層級(jí)中最大基因拷貝數(shù)的比值[31]。

表2 功能基因qPCR擴(kuò)增體系Table 2 qPCR reaction system of functional gene used in the experiment

1.1 1數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所采集的數(shù)據(jù)使用Microsoft office excel 2013和SPSS 23.0進(jìn)行相關(guān)分析與作圖，處理之間的平均值差異采用One-Way ANOVA單因素方差分析，P＜0.05表示顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株和土壤樣品中15N同位素豐度

不同處理下植株和土壤樣品同位素豐度差異顯著（表3），標(biāo)記單作處理和間作處理的大豆地上部、大豆根和大豆根圍土樣品均檢測(cè)到較高的15N豐度，且都顯著高于對(duì)照組。間作處理的15N同位素豐度高于單作處理。大豆地上部、大豆根和大豆根圍土中15N同位素豐度依次遞減，大豆地上部最高，大豆根圍土中最低。同時(shí)在15N標(biāo)記間作處理中的甘蔗根和甘蔗地上部中也檢測(cè)到較高的15N同位素豐度，且標(biāo)記處理的豐度顯著高于對(duì)照處理。

表3 不同處理中植株及土壤15N同位素豐度Table 3 δ15N of plant and soil in different treatments

2.2 功能基因qPCR鑒定15N-DNA富集位置

以各處理的大豆根際土壤微生物DNA為模板，采用功能基因特異性引物定量6個(gè)氮素循環(huán)功能基因在不同CsCl浮力密度層級(jí)中的拷貝數(shù)，將原始基因拷貝數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為功能基因相對(duì)豐度后作圖分析。不同處理和標(biāo)記方式下功能基因相對(duì)豐度隨著浮力密度增大均呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，形狀如拋物線，各功能基因在不同浮力密度層級(jí)的分布差異較大，但都主要集中于峰值附近（圖2）。從不同密度梯度分層樣品中功能基因的相對(duì)豐度顯示，調(diào)控固氮過程的nifH基因（圖2a）和調(diào)控硝化過程amoA基因（圖2c）無論是在甘蔗//大豆間作還是大豆單作處理，其相對(duì)豐度高峰值位置均與參比對(duì)照處理存在明顯的偏移，15N標(biāo)記的兩種種植模式中nifH基因相對(duì)豐度最高峰出現(xiàn)在1.723 g·mL-1的浮力密度層，而參比對(duì)照的nifH基因相對(duì)豐度高峰出現(xiàn)在1.713 g·mL-1的浮力密度層，兩個(gè)層級(jí)密度差約為0.010 g·mL-1；amoA基因在15N標(biāo)記的兩種種植模式中相對(duì)豐度高峰出現(xiàn)在1.718 g·mL-1的浮力密度層，而參比對(duì)照的amoA基因相對(duì)豐度高峰出現(xiàn)在1.713 g·mL-1的浮力密度層，兩個(gè)層級(jí)密度差為0.005 g·mL-1；調(diào)控有機(jī)氮礦化過程的chiA基因（圖2b）相對(duì)豐度高峰在15N標(biāo)記的大豆單作處理中與參比對(duì)照組存在偏移，15N單作處理的chiA基因相對(duì)豐度高峰出現(xiàn)在浮力密度為1.718 g·mL-1的層級(jí)，參比對(duì)照組中基因相對(duì)豐度高峰在浮力密度為1.713 g·mL-1的層級(jí)，兩個(gè)層級(jí)密度差為0.005 g·mL-1，而15N標(biāo)記的間作處理與參比對(duì)照組中基因相對(duì)豐度高峰重疊；調(diào)控反硝化過程的nirK（圖2d）、nirS（圖2e）和nosZ（圖2f）基因中，根據(jù)相對(duì)豐度高峰位置顯示，參比對(duì)照組基因相對(duì)豐度高峰所對(duì)應(yīng)浮力密度高于15N標(biāo)記的單作和間作處理，與預(yù)期判斷結(jié)果相反。

3 討論

通過樣品同位素豐度測(cè)定結(jié)果可知，標(biāo)記處理中15N豐度顯著升高，大豆葉柄注射標(biāo)記的15N被大豆同化吸收后參與其新陳代謝，通過根系分泌物、細(xì)胞死亡凋落等方式釋放到土壤中，進(jìn)入土壤氮素循環(huán)，經(jīng)土壤微生物吸收轉(zhuǎn)化后，被間作的甘蔗吸收利用，在甘蔗//大豆間作系統(tǒng)中發(fā)生氮素轉(zhuǎn)移，因此，證明15N成功標(biāo)記到作物、土壤及土壤微生物，并被作物、土壤及土壤微生物所富集。

使用DNA-SIP技術(shù)分離被標(biāo)記的土樣微生物DNA，并采用qPCR檢測(cè)不同浮力密度層級(jí)DNA中氮素循環(huán)功能基因的相對(duì)豐度分布，基因相對(duì)豐度高的密度層級(jí)代表著DNA富集程度也高，因此可根據(jù)基因相對(duì)豐度峰的位置判斷DNA在離心液中富集位置。與參比對(duì)照組N-DNA相比，被標(biāo)記的15N-DNA理論上應(yīng)集中于浮力密度更高的層級(jí)，通過對(duì)比兩者在不同浮力密度梯度區(qū)帶中的位移，也即通過對(duì)比對(duì)照處理與標(biāo)記處理所對(duì)應(yīng)的功能基因相對(duì)豐度高峰的位置鑒別未標(biāo)記N-DNA與15N-DNA分離情況，若對(duì)照組與標(biāo)記組中功能基因相對(duì)豐度高峰有偏移，則代表分離成功，且基因相對(duì)豐度高峰所對(duì)應(yīng)的高浮力密度層級(jí)即為15N-DNA富集區(qū)帶，反之則分離失敗。

nifH基因和amoA基因在甘蔗//大豆間作和大豆單作處理中，15N標(biāo)記處理的基因相對(duì)豐度高峰值位置均與參比對(duì)照處理存在明顯的偏移，因此說明nifH基因和amoA基因能夠清晰判斷甘蔗//大豆間作和大豆單作DNA-SIP中15N-DNA富集位置。chiA基因相對(duì)豐度高峰僅在15N標(biāo)記的大豆單作處理中與參比對(duì)照組存在偏移，而15N標(biāo)記的間作處理與參比對(duì)照組中基因相對(duì)豐度高峰重疊，因此說明chiA基因只能夠鑒別單作處理下DNA-SIP中15N-DNA富集位置，造成這種結(jié)果的原因可能是注射相同量的15N溶液，單作處理的根室體積較間作小，根際土壤少，因此土壤中15N濃度較高，容易被富集。nirK、nirS和nosZ在14N對(duì)照組基因相對(duì)豐度高峰所對(duì)應(yīng)浮力密度高于15N標(biāo)記的單作和間作處理，與預(yù)期判斷結(jié)果相反，Buckley等[32]用15N2-DNA-SIP研究甲烷氧化菌時(shí)也曾出現(xiàn)類似的結(jié)果，因此調(diào)控反硝化過程的nirK、nirS和nosZ基因不能夠有效鑒別間作系統(tǒng)中DNA-SIP的15NDNA富集位置。

圖2 不同浮力密度層級(jí)中功能基因相對(duì)豐度的分布Figure 2 Distribution of the relative abundance of functional gene in CsCl gradient

由于室內(nèi)盆栽試驗(yàn)嚴(yán)格控制了土壤水熱條件，因此盆栽土壤中主要發(fā)生固氮作用、氨化作用和硝化作用等生態(tài)過程，反硝化作用相對(duì)較弱，進(jìn)而調(diào)控反硝化過程的功能基因豐度相對(duì)低，因此標(biāo)記的15N進(jìn)入土壤后，主要被固氮作用、氨化作用和硝化作用等的微生物所同化，進(jìn)而調(diào)控該過程的功能基因富集了更多的15N。在本試驗(yàn)中，注射的15N溶液進(jìn)入大豆體內(nèi)后，會(huì)很容易被共生固氮菌同化吸收，當(dāng)根系分泌物或凋落物進(jìn)入土壤后，被有機(jī)氮礦化微生物礦化分解，被分解后的無機(jī)氮會(huì)進(jìn)一步發(fā)生硝化作用，因此調(diào)控這些生態(tài)過程的nifH基因、amoA基因和chiA基因相對(duì)容易被標(biāo)記，進(jìn)而在DNA-SIP的分層中檢測(cè)相對(duì)靈敏。而調(diào)控反硝化過程的功能基因豐度較低，因此nirK、nirS和nosZ基因富集到15N的量較少，所以在DNA-SIP分層中檢測(cè)靈敏度相對(duì)低，不易檢測(cè)。

4 結(jié)論

本文通過qPCR技術(shù)定量檢測(cè)了調(diào)控氮素循環(huán)的功能基因在超高速離心后不同浮力密度層級(jí)中的豐度分布，通過對(duì)比分析篩選出nifH基因和amoA基因作為指示基因，可準(zhǔn)確鑒定甘蔗//大豆間作系統(tǒng)中DNA-SIP的15N-DNA富集位置，為甘蔗//大豆間作系統(tǒng)中土壤氮素循環(huán)核心微生物的分離及其下游研究工作的開展提供了新方法。在同位素原位標(biāo)記分析的基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)揭示農(nóng)田間作系統(tǒng)中參與氮素循環(huán)核心微生物的多樣性，將為科學(xué)揭示農(nóng)田氮素循環(huán)過程的微生物調(diào)控機(jī)理奠定技術(shù)基礎(chǔ)。