高效液相色譜測(cè)定乳制品、谷物粉及飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物

武倫瑋，岳 虹，陳 靜，劉春霞，劉麗君

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又稱嘔吐毒素，是一種來(lái)源于鐮刀菌屬的單端孢霉烯族化合物。3-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-acetyldeoxynivalenol，3-ADON）和15-乙酰基-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-acetyl-deoxynivalenol，15-ADON）為DON的乙?；苌铩Ｊ秤帽籇ON污染的食物后，會(huì)產(chǎn)生惡心、嘔吐、腹瀉等急性中毒癥狀。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，DON及其衍生物可以和其他真菌毒素產(chǎn)生聯(lián)合作用，加劇動(dòng)物肝、腎臟細(xì)胞膜損傷和氧化損傷，導(dǎo)致動(dòng)物過(guò)早死亡[1-2]。目前，同時(shí)檢測(cè)DON及其乙酰化衍生物的方法大多是使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]，該方法對(duì)硬件設(shè)備和人員的要求較高，推廣起來(lái)相比液相色譜法相對(duì)較難[4-6]。本研究建立一種適合乳制品和普通飼料基質(zhì)的可同時(shí)測(cè)定DON及其乙?；苌锏母咝б合嗌V（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析方法，以供檢驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純） 諾爾施（成都科隆化學(xué)品有限公司）；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀（均為分析純） 天津風(fēng)船化學(xué)試劑公司；鹽酸（分析純） 北京試劑公司；DON、3-ADON、15-ADON標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

飼料采集自伊利牧場(chǎng)；谷粒多牛乳、益消風(fēng)味酸乳及薏米粉 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇3 項(xiàng)（DON/3-ADON/15-ADON）免疫親和柱（產(chǎn)品編號(hào)：HCM30508，柱容量≥1 000 ng） 北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀（配備紫外檢測(cè)器）美國(guó)Agilent公司；AB265-S分析天平 瑞士Mettler-Doledo公司；3k30高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；GM 200高速粉碎機(jī)（轉(zhuǎn)速10 000 r/min） 德國(guó)Retsch公司；篩網(wǎng)（孔徑1～2 mm） 安平縣鴻凱金屬絲網(wǎng)制品廠；TurboVapLV氮吹儀 瑞典Biotage公司；KQ-600DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；VORTEX 2渦旋振蕩器 德國(guó)IKA公司；HY-5搖床江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；移液器（量程10～100 μL和100～1 000 μL） 德國(guó)Eppendorf公司；玻璃纖維濾紙（直徑11 cm，孔徑1.5 μm） 美國(guó)Vicam公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

液相色譜柱：艾杰爾Venusil MP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）或相當(dāng)者[7-8]；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)224 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量50 μL；流動(dòng)相梯度洗脫程序如表1所示。

表 1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient mobile phase composition

1.3.2 溶液配制

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）：稱取8.00 g NaCl、0.20 g KCl、0.20 g KH2PO4和1.16 g Na2HPO4·12H2O，加入800 mL超純水溶解并定容至1 L；體積分?jǐn)?shù)80%乙腈水溶液：將800 mL乙腈和200 mL水混合；體積分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-20水溶液：取1 mL 吐溫-20，加水定容至1 L。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100 μg/mL）：分別稱取DON、3-ADON和15-ADON各1 mg（準(zhǔn)確至0.01 mg），分別用乙腈溶解并定容至10 mL，-20 ℃條件下密封保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）：分別準(zhǔn)確吸取100 μg/mL DON、3-ADON和15-ADON標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1.0 mL于同一10 mL容量瓶中，加乙腈定容，-20 ℃條件下密封保存。

與新款外觀設(shè)計(jì)所匹配的是經(jīng)過(guò)全新升級(jí)的前后燈光組件。新一代C級(jí)長(zhǎng)軸距車(chē)型上標(biāo)配LED幾何多光束大燈，大燈內(nèi)有84顆可獨(dú)立點(diǎn)亮或熄滅的LED光源，不僅能實(shí)現(xiàn)智能的光束變化，還擁有最遠(yuǎn)650米的照明距離。同時(shí)，尾燈設(shè)計(jì)也經(jīng)過(guò)了修改，燈帶點(diǎn)亮之后呈C字形，讓新一代C級(jí)轎車(chē)在夜晚更具辨識(shí)度。

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用流動(dòng)相（乙腈∶水=12∶88，V/V）稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃條件下保存。

1.3.3 樣品處理

1.3.3.1 配合飼料、濃縮料、精補(bǔ)料等吸水性較小的樣本

將樣品粉碎，準(zhǔn)確稱取4 g樣品，加入20 mL PBS緩沖溶液；用搖床劇烈振蕩20 min，充分提取，5 000 r/min離心5 min，調(diào)節(jié)pH值至中性，用微纖維濾紙過(guò)濾；取5 mL濾液過(guò)免疫親和柱凈化，濾液以1～2 滴/s的速率流出；待液體流出后用20 mL水淋洗免疫親和柱，流速2～3 滴/s，并充分排干；取2 mL甲醇洗脫，用玻璃試管接洗脫液，流速1 滴/s；洗脫后液體于50 ℃條件下經(jīng)氮吹儀吹干，殘余物于4 ℃條件下存放，使用時(shí)用1 mL 20%乙腈溶液復(fù)溶；過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)[9-11]。

1.3.3.2 乳制品

準(zhǔn)確稱取2.5 g樣品于10 mL容量瓶，使用PBS緩沖液定容，搖床振蕩20 min，充分提取，5 000 r/min離心5 min，用微纖維濾紙過(guò)濾[12-13]；取2 mL濾液過(guò)免疫親和柱凈化，濾液以1～2 滴/s的速率流出，待液體流出后用10 mL 0.1%吐溫水溶液淋洗免疫親和柱，流速2～3 滴/s，再用10 mL水淋洗，并充分排干；取2 mL甲醇洗脫，用玻璃試管接洗脫液，流速1 滴/s，洗脫后液體于50 ℃條件下用氮吹儀吹干，殘余物于4 ℃存放，使用時(shí)用1 mL 20%乙腈溶液復(fù)溶，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)。

1.3.3.3 谷物粉、米粉

準(zhǔn)確稱取4 g樣品（固體樣品需粉碎過(guò)篩），以1∶4（m/V）的比例加入80%乙腈水溶液（即16 mL）[14-16]，混勻，超聲提取1 5 m i n；取4 m L液體，以1∶7（m/V）的比例加入PBS緩沖液（即28 mL）稀釋，混勻，使用玻璃纖維濾紙過(guò)濾；取16 mL濾液過(guò)免疫親和柱凈化，濾液以1～2 滴/s的速率流出；待液體流出后，用10 mL 0.1%吐溫水溶液淋洗免疫親和柱，流速2～3 滴/s，再用10 mL水淋洗，并充分排干；取2 mL甲醇洗脫，用玻璃試管接洗脫液，流速1 滴/s；洗脫后液體于50 ℃條件下用氮吹儀吹干，殘余物于4 ℃存放，使用時(shí)用1 mL 20%乙腈溶液復(fù)溶；過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)。

試樣中DON、15-ADON或3-ADON的含量按照下式計(jì)算。

式中：X為試樣中DON、3-ADON或15-ADON的含量/（μg/kg）；ρ1為試樣中DON、3-ADON或15-ADON的質(zhì)量濃度/（ng/mL）；ρ0為空白試樣中DON、3-ADON或15-ADON的質(zhì)量濃度/（ng/mL）；V為樣品洗脫液的最終定容體積/mL；f為樣液稀釋因子；m為試樣質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

DON易溶于極性溶劑，如水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯，吸水性較小的樣本可以直接用水提取，既有較高的提取效率、又經(jīng)濟(jì)無(wú)毒。而選擇PBS緩沖鹽體系，則是為了保證溶液體系呈中性，以保證免疫親和柱不失活。對(duì)于吸水性較大的樣品則需要添加沉淀劑，加入80%乙腈水溶液，然后將乙腈提取液稀釋到一定比例，是為了防止乙腈破壞免疫親和柱，使免疫親和柱失活。DON及其乙?；苌餃y(cè)定的基礎(chǔ)是抗原和抗體反應(yīng)，抗體連接在柱體內(nèi)，樣品經(jīng)過(guò)提取、過(guò)濾后緩慢通過(guò)免疫親和柱，在免疫親和柱內(nèi)毒素與抗體結(jié)合，之后洗滌免疫親和柱，除去沒(méi)有被結(jié)合的其他無(wú)關(guān)物質(zhì)[14-16]。用甲醇洗脫，然后注入液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 色譜柱和流動(dòng)相的選擇

采用艾杰爾Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，對(duì)于其他C18色譜柱，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，色譜峰有可能會(huì)出現(xiàn)15-ADON、3-ADON被雜質(zhì)峰覆蓋等情況。流動(dòng)相選擇乙腈和水，在目標(biāo)峰周?chē)鸁o(wú)雜峰干擾，定量準(zhǔn)確。如果使用甲醇和水進(jìn)行洗脫，效果不太理想，或在上述條件下無(wú)法分離目標(biāo)化合物。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

將不同質(zhì)量濃度的DON、15-ADON或3-ADON工作液在上述洗脫條件下經(jīng)液相色譜儀測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表 2 DON、3-ADON及15-ADON的標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限Table 2 Standard curves and limits of quantitation for DON, 3-ADON and 15-ADON

由表2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，按照信噪比（RS/N）=10，計(jì)算得出該方法的定量限為100 μg/kg。

將DON、15-ADON及3-ADON的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品按照上述色譜條件進(jìn)樣，所得色譜圖如圖1所示。飼料樣品中加入DON、15-ADON及3-ADON的混合標(biāo)準(zhǔn)品后所得色譜圖如圖2所示。

2.4 方法回收率和精密度

分別向飼料、谷物乳、發(fā)酵乳和谷物粉中添加不同質(zhì)量濃度的DON、15-ADON和3-ADON，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分別平行測(cè)定6 次。

表 3 不同樣品的加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果（n= 6）Table 3 Recoveries of spiked samples (n= 6)

由表3可知，本底樣品中DON、15-ADON和3-ADON的添加量為100～500 μg/kg時(shí)，飼料、谷物乳、發(fā)酵乳和谷物粉中的回收率分別為84.4%～99.9%、94.3%～101.6%、96.0%～103.7%和88.8%～100.0%。

表 4 不同樣品的精密度測(cè)定結(jié)果Table 4 Precision (RSD) for replication determinations of different samples

對(duì)飼料、谷物乳、發(fā)酵乳和谷物粉檢出限附近的加標(biāo)樣品分別進(jìn)行6 次重復(fù)測(cè)定。由表4可知，本方法的準(zhǔn)確度滿足定量要求，方法精密度良好。

3 結(jié) 論

本研究采用HPLC法對(duì)乳品和飼料中的DON及其乙?；苌镞M(jìn)行含量測(cè)定，本方法適用于飼料、液態(tài)乳、酸乳、米粉及谷物粉中DON及其乙?；苌锏暮繖z測(cè)。樣品中加入PBS緩沖溶液作為提取劑，采用免疫親和柱凈化，氮吹儀濃縮后用流動(dòng)相復(fù)溶，C18色譜柱分離，流動(dòng)相為乙腈和水，進(jìn)行梯度洗脫，目標(biāo)峰不受雜質(zhì)峰干擾，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。