基于離子液體-雙水相體系同時(shí)測(cè)定蜂蜜中3種三嗪類除草劑殘留

田宏哲，張明浩，周鑫杰，袁寶輝，張晨光

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

三嗪類除草劑被廣泛應(yīng)用于防治田間雜草,提高農(nóng)作物產(chǎn)量[1]。但該類除草劑的大量使用對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成了極大危害[2-3]。因此，為保障農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境安全[3-4]，亟需建立經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)單和靈敏的三嗪類除草劑殘留的分析方法。為降低實(shí)際樣品中基質(zhì)和雜質(zhì)對(duì)待測(cè)物質(zhì)測(cè)定的影響，常需采用合適的樣品處理方法。目前，三嗪類除草劑的萃取方法有液-液萃取法[5]、固相萃取或固相微萃取法[6-8]、分散液液微萃取法(DLLME)[9-10]、其它微萃取方法[11-13]和加速溶劑萃取法[14]，但液-液萃取法步驟繁瑣，需使用大量有害和揮發(fā)性有機(jī)溶劑；加速溶劑萃取法在高溫高壓下采用有機(jī)溶劑進(jìn)行樣品萃取，對(duì)環(huán)境危害較大；其余萃取方法雖可降低有機(jī)溶劑用量，但存在重復(fù)性差和樣品殘留問題。

20世紀(jì)60年代Albertsson等[15]最先建立雙水相萃取體系(ABS)，然而早期的雙水相體系多采用兩種聚合物[16]或聚合物與無機(jī)鹽[17]形成，其原理是兩種聚合物或聚合物與鹽之間在一定濃度上由于排斥作用互不兼容從而形成兩相體系。與傳統(tǒng)的液-液萃取法相比，雙水相體系具有低能耗、易于規(guī)?；傲己玫沫h(huán)境兼容性等優(yōu)勢(shì)，但兩相間有限的極性區(qū)間限制了其廣泛應(yīng)用。離子液體(IL)是由不同陽離子和陰離子形成的在室溫或接近室溫下呈液體狀態(tài)的有機(jī)鹽[18]，與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑相比，離子液體具有不可燃性、電導(dǎo)率高、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性高、不易揮發(fā)等優(yōu)勢(shì)，作為“綠色”溶劑在農(nóng)藥殘留萃取方面具有極大的潛力。

2003年Rogers等[19]首次采用咪唑類離子液體與磷酸鉀建立雙水相體系，隨后引起了研究者的廣泛關(guān)注。離子液體與無機(jī)鹽[20-21]、聚合物[22- 23]、表面活性劑[24-25]等均可形成雙水相體系，該體系具有粘度低和環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，已在有機(jī)污染物萃取領(lǐng)域有一定應(yīng)用，但目前尚未對(duì)其在農(nóng)藥殘留萃取方面進(jìn)行深入研究[20,26-27]。

本文基于非離子表面活性劑曲拉通 x-100(Triton x-100，簡(jiǎn)寫為Tr)，以及醋酸膽堿([Ch][Ac])、丙酸膽堿([Ch][Pro])、丁酸膽堿 ([Ch][But]) 等不同類型的離子液體和水形成的ABS差異，選擇[Ch][Ac]和Tr建立ABS，比較了不同溫度對(duì)該ABS相圖的影響。確定了不同萃取條件對(duì)三嗪類除草劑分配系數(shù)的影響，明確了待測(cè)組分在該體系中的萃取行為,從而為采用雙水相體系萃取該類除草劑殘留提供了重要的理論依據(jù)及參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 高效液相色譜(美國(guó)Agilent公司)；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、RT10磁力攪拌器(德國(guó)IKA公司)；XH-C渦流混合器(常州浪躍儀器制造有限公司)；DT5-1離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)公司)；Modulyo-D冷凍干燥儀(美國(guó)Labconco公司)；AVANEC-600核磁共振波譜儀(600 Ultra Shield，德國(guó)Bruker公司)；IRAffinnity-1S紅外光譜儀(日本島津公司)。

甲醇、乙腈(色譜純)，Tr (試劑級(jí))，氫氧化膽堿(水中質(zhì)量分?jǐn)?shù)46%)，丙酸、冰醋酸及丁酸(純度>99.5%)，西瑪津、氰草津及阿特拉津(純度≥ 98.0%)，上述試劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。實(shí)驗(yàn)用水為“娃哈哈”純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán))，其它試劑均為分析純。蜂蜜樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?，分別為1種棗花蜜，2種椴樹蜜，2種槐花蜜。

采用甲醇制備各除草劑的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 (1.0 g/L)，以甲醇稀釋制備100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后以甲醇逐級(jí)稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 離子液體的合成及結(jié)構(gòu)鑒定

通過酸堿中和反應(yīng)制備離子液體：將有機(jī)酸(0.1 mol)的甲醇溶液加入250 mL圓底燒瓶中，然后將等物質(zhì)的量的氫氧化膽堿水溶液加至相應(yīng)的有機(jī)酸溶液中，混合物在室溫(25 ℃)下連續(xù)攪拌12 h。所得混合溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑后，采用冷凍干燥儀真空干燥4～5 d去除水分。

采用核磁共振(NMR)波譜儀和紅外光譜儀測(cè)定離子液體的化學(xué)結(jié)構(gòu)及純度，該類膽堿離子液體的紅外光譜與氯化膽堿[28]的譜圖相似，特征峰如下：3 145、3 025、2 850、1 573、1 386、1 080 cm-1。NMR數(shù)據(jù)參見文獻(xiàn)[20,24]，測(cè)定結(jié)果證實(shí)了各離子液體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，同時(shí)根據(jù)積分面積比值確定各離子液體的純度均大于95%。

1.3 雙水相體系的制備

1.3.1相圖繪制向含有已知濃度Tr的試管中滴加IL溶液，直至混合物變渾濁，然后加入水使混合物再次澄清。根據(jù)所有加入組分的質(zhì)量計(jì)算各相組分的濃度。重復(fù)上述過程，獲得足夠的數(shù)據(jù)繪制ABS相圖。

1.4 ABS萃取三嗪類除草劑

首先考察了不同萃取條件對(duì)待測(cè)組分分配系數(shù)的影響：向10.0 mL離心管中,依次加入Tr、IL、水和除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液,形成基于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Tr 和[Ch][Ac]的ABS體系。室溫下將該混合溶液劇烈混合2 min,以 4 000 r/min離心10 min后,靜置2 h。相分離后,記錄兩相的質(zhì)量和體積。上相主要由[Ch][Ac]和水組成,下相主要由Tr、水和除草劑組成。將兩相經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后,依次采用HPLC法測(cè)定待測(cè)組分。以其在Tr相和IL相中的濃度之比為待測(cè)組分的分配系數(shù)(K)，計(jì)算公式為：K=CTr/CIL，式中，IL和Tr分別代表IL和Tr相,C為待測(cè)組分的濃度。

隨后采用該ABS體系測(cè)定加標(biāo)樣品及實(shí)際樣品。實(shí)際樣品處理方法：稱取10 g蜂蜜樣品于100 mL離心管中，加入20 mL水，混勻，備用。加標(biāo)樣品制備：向空白樣品中加入待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制添加水平為0.02、0.05、0.2 mg/kg的加標(biāo)樣品。向離心管中依次加入Tr、IL、加標(biāo)樣品或?qū)嶋H樣品，形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.80% Tr和35.05% IL的萃取體系，然后按上述步驟處理，采用HPLC法測(cè)定待測(cè)組分含量。同時(shí)按照上述萃取步驟，測(cè)定空白樣品進(jìn)行對(duì)照。

1.5 液相色譜條件

Zorbax Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Agilent公司)，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。流動(dòng)相：A為水，B為乙腈(ACN)，梯度洗脫程序：0～20 min，30%～50%B；20～25 min，50%～85%B；25～26 min,85%～95%B，保持4 min；回到初始狀態(tài)，平衡5 min。

圖1 不同離子液體對(duì)雙水相體系相圖的影響Fig.1 Effect of different ionic liquids on the phase diagram of ABSs

2 結(jié)果與討論

2.1 基于膽堿離子液體的雙水相體系相圖

2.1.1離子液體對(duì)雙水相體系的影響在室溫下繪制由水、Tr和不同膽堿離子液體([Ch][Ac]、[Ch][Pro]和[Ch][But])組成的雙水相體系的相圖，考察了不同離子液體對(duì)雙水相體系溶解度曲線的影響(圖1)。圖中溶解度曲線以下的區(qū)域?yàn)殡p相區(qū)，上方的區(qū)域?yàn)榫鄥^(qū)。結(jié)果顯示，不同離子液體組成的雙水相體系的溶解度曲線呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，而雙水相體系的雙相區(qū)面積大小順序?yàn)椋篬Ch][Ac]>[Ch][Pro]>[Ch][But]，表明該類離子液體的相形成能力隨離子液體陰離子的碳鏈長(zhǎng)度增加而降低。這是由于鹽析效應(yīng)的影響，碳鏈較長(zhǎng)的離子液體疏水性更強(qiáng)，與水的親和力減弱，難以將表面活性劑鹽析形成另一相?？紤]到各離子液體的鹽析能力，選擇[Ch][Ac]與Tr構(gòu)建ABS。

2.1.2溫度對(duì)雙水相體系的影響考察了不同溫度(298.2、308.2、318.2 K)對(duì)Tr-[Ch][Ac]體系相行為的影響。由于雙水相體系的形成為吸熱過程，雙相區(qū)面積隨著溫度的升高而增大，Tr和[Ch][Ac]形成雙水相體系的能力增強(qiáng)。但不同溫度對(duì)該體系雙相區(qū)面積的影響并不顯著，因此選擇在室溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同萃取條件的影響

西瑪津、氰草津和阿特拉津的pKa值分別為1.62、0.63和1.70[29-30]，該類除草劑在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性溶液中易降解。而[Ch][Ac]-Tr體系中離子液體相(上相)和表面活性劑相(下相)的pH值分別為弱堿性和中性 (pH 6～8)，因此在該雙水相體系提取過程中,待測(cè)組分較穩(wěn)定。在萃取過程中，由于表面活性劑比離子液體的疏水性更強(qiáng)，待測(cè)組分通過疏水相互作用主要富集在表面活性劑相。這與待測(cè)組分的油/水分配系數(shù)(Ko/w)相一致，其中西瑪津、氰草津和阿特拉津的Ko/w分別為2.18、2.22和2.61[31]。

研究表明[17]雙水相體系中兩相組分的含量顯著影響目標(biāo)組分的分配系數(shù)(K)，由于在雙水相體系中不同系線長(zhǎng)度可以反映兩相組分的不同含量,所以系線長(zhǎng)度(TLL)也會(huì)影響待測(cè)組分的分配系數(shù)。因此,本文研究了待測(cè)組分的K值與TLL之間的關(guān)系。

2.2.1離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)待測(cè)組分分配系數(shù)的影響以10%Tr與不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的[Ch][Ac](20%～40%)建立了5個(gè)ABS體系，對(duì)應(yīng)的系線長(zhǎng)度(以100TLL表示，100倍TLL)隨著[Ch][Ac]質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增大?？疾炝瞬煌稻€長(zhǎng)度下[Ch][Ac]質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)待測(cè)組分分配系數(shù)的影響(圖2A)，結(jié)果表明，待測(cè)組分的K值隨系線長(zhǎng)度的增大而增加，即隨[Ch][Ac]質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增大，進(jìn)一步證實(shí)了鹽析作用是該體系的相分離機(jī)理。

2.2.2表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)待測(cè)組分分配系數(shù)的影響以20%[Ch][Ac]和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Tr(10%～30%)建立了5個(gè)ABS體系，對(duì)應(yīng)的系線長(zhǎng)度隨著Tr質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增大?？疾炝瞬煌稻€長(zhǎng)度下Tr質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)待測(cè)組分分配系數(shù)的影響(圖2B)，結(jié)果表明，待測(cè)除草劑的分配系數(shù)隨系線長(zhǎng)度的增大而降低，即隨Tr質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而降低。這是由于表面活性劑相的體積增大產(chǎn)生了稀釋效應(yīng)，使待測(cè)組分在該相的濃度降低。同時(shí)，表面活性劑相的粘度隨著體系中表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大，從而降低了萃取過程中待測(cè)組分在兩相間的傳質(zhì)速度。因此，隨著Tr質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，待測(cè)除草劑在表面活性劑相的溶解度由于傳質(zhì)和稀釋效應(yīng)的影響而降低。

上述研究表明，在Tr-[Ch][Ac]雙水相體系中，K值隨著離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大，而隨著表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低。因此，可通過降低Tr質(zhì)量分?jǐn)?shù)及提高[Ch][Ac]質(zhì)量分?jǐn)?shù)來提高待測(cè)組分的K值及萃取效率，但Tr的質(zhì)量分?jǐn)?shù)太低，表面活性劑相收集困難，而[Ch][Ac]達(dá)35%后待測(cè)組分的萃取效率趨于穩(wěn)定，因此選擇Tr和[Ch][Ac]的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.80%和35.05%。

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1線性關(guān)系與定量下限在上述優(yōu)化條件下，采用建立的方法測(cè)定0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以所得峰面積為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3種待測(cè)組分在0.1～20.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)不低于 0.992。以未檢出待測(cè)化合物的市售蜂蜜樣品為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，以10倍信噪比(S/N=10)確定西瑪津、氰草津及阿特拉津的定量下限分別為0.005、0.02、0.01 mg/kg，均小于目前歐盟對(duì)蜂蜜中待測(cè)除草劑的最大殘留限量(西瑪津和阿特拉津的最大殘留限量分別為0.01、0.05 mg/kg，氰草津尚無蜂蜜中的最大殘留限量)，因此本方法符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

2.3.2回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以未檢出待測(cè)化合物的市售蜂蜜樣品為空白樣品，通過加標(biāo)實(shí)驗(yàn)對(duì)該萃取方法進(jìn)行驗(yàn)證，加標(biāo)濃度分別為0.02、0.05、0.2 mg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平平行實(shí)驗(yàn)5次，得到待測(cè)組分的平均回收率為75.0%～114%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%～7.6%，本方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足殘留分析的要求。

2.3.3基質(zhì)與相組分的影響圖3為采用該方法測(cè)定空白樣品加標(biāo)0.05 mg/kg的色譜圖，結(jié)果表明，基質(zhì)成分與相組分均不會(huì)干擾目標(biāo)除草劑的分離和檢測(cè)。因此，該雙水相體系可應(yīng)用于實(shí)際樣品中待測(cè)組分的萃取分離。

2.4 實(shí)際樣品分析

為評(píng)價(jià)該ABS體系在實(shí)際樣品分析中的萃取性能，在上述優(yōu)化條件下將該體系應(yīng)用于5種市售蜂蜜樣品的萃取分離。稱取約12.0 g蜂蜜樣品，分別加入0.76 g Tr和7.01 g[Ch][Ac]形成萃取體系(其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.80%和35.05%)，按“1.4”條件進(jìn)行樣品處理。結(jié)果表明，所有待測(cè)樣品中均未檢出此3種除草劑。

3 結(jié) 論

本文建立了基于離子液體[Ch][Ac]和表面活性劑Tr的雙水相體系萃取分離結(jié)合高效液相色譜測(cè)定蜂蜜中3種三嗪類除草劑殘留的分析方法，待測(cè)組分的定量下限為0.005～0.02 mg/kg，加標(biāo)回收率為75.0%～114%。與傳統(tǒng)的樣品處理方法相比,該方法操作簡(jiǎn)單、溫和、環(huán)境友好,適于高通量的樣品處理，在農(nóng)藥殘留分析中具有較好的應(yīng)用前景。