固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析乙烯利在棉籽、棉葉和土壤中的殘留

湯 濤，張昌朋，吳 珉，許振嵐，何紅梅，張春榮，趙學(xué)平

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所/省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地“浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”/農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

乙烯利(Ethephon)又名乙烯磷,是一種人工合成的植物生長調(diào)節(jié)激素，可以釋放出乙烯，具有促進(jìn)果實(shí)成熟、調(diào)節(jié)性別轉(zhuǎn)化等作用，常作為脫葉劑應(yīng)用于棉花作物[1-2]。已有的研究表明乙烯利具有神經(jīng)毒性，對(duì)皮膚、眼睛、黏膜有刺激作用，食用過量乙烯利可加速消化道衰老，造成消化道潰瘍，影響大腦和腎臟健康，對(duì)動(dòng)物免疫和生殖系統(tǒng)也有一定的損害[3-4]。棉籽油具有天然的抗氧化能力，是我國棉花主產(chǎn)區(qū)居民的主要食用植物油之一，年產(chǎn)量居我國食用植物油的第四位，同時(shí)棉籽經(jīng)脫殼提油后所得的棉籽粕中，蛋白質(zhì)含量可達(dá)40%～50%，在質(zhì)量上近似豆類蛋白，是畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展的優(yōu)質(zhì)飼料[5-7]。乙烯利的每日允許攝入量(Acceptable daily intake,ADI)為0.05 mg/kg bw，我國規(guī)定其在棉籽中的最大殘留限量(Maximum residue limit,MRL)為2 mg/kg[8]。目前已報(bào)道的關(guān)于乙烯利的檢測(cè)方法主要有離子色譜法[9-12]、氣相色譜法[13-14]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-18]。其中，離子色譜法為半定性分析，很難對(duì)乙烯利殘留進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測(cè)；氣相色譜法一般需要進(jìn)行衍生化，或使其在堿性條件下加熱分解出乙烯，再結(jié)合頂空進(jìn)樣方式進(jìn)行檢測(cè)，該方法的樣品前處理步驟多、操作復(fù)雜，且定量的準(zhǔn)確性易受衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性或釋放出乙烯的量所限制。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)具有靈敏度高、選擇性好、特異性強(qiáng)和分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，Xie等[16]采用LC-MS/MS方法分析了乙烯利、噻苯隆和敵草隆等植物生長調(diào)節(jié)劑在棉花中的殘留量，測(cè)得乙烯利在棉花中的檢測(cè)定量限(LOQ)為0.04 mg/kg，Su等[17]采用QuEChERS結(jié)合LC-MS/MS方法檢測(cè)了多種果蔬中的乙烯利殘留量，樣品經(jīng)石墨化碳(GCB)和N-丙基乙二胺(PSA)凈化后檢測(cè)，測(cè)得乙烯利在黃瓜等果樹中的LOQ為1.2～2.2 mg/kg。

本研究以棉籽、棉葉和土壤為供試材料，采用固相萃取法結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)，擬開發(fā)靈敏度更高的乙烯利分析方法，通過對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)來驗(yàn)證方法的可靠性，所建方法有望用于棉籽中乙烯利殘留的抽檢監(jiān)測(cè)及該藥的殘留登記試驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試材

UPLC-MS/MS-8050超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；SPS402F電子天平(精確至 0.01 g，奧豪斯公司)；AB135-S 電子天平(精確至0.1 mg，梅特勒-托利多公司)；TYZD-IIA振蕩器(天儀電子儀器有限公司)；VTX-3000L渦旋儀(杭州雷琪試驗(yàn)器材公司)；12通道固相萃取裝置(美國Supelco公司)；3-18k高速離心機(jī)(德國Sigma公司)；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀及V-700真空泵(瑞士Buchi公司)。

乙烯利標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)；75%乙烯利水劑(紹興市東湖生化有限公司)；Oasis MAX(3 cc,60 mg)、Oasis HLB(3 cc,60 mg)和Oasis WAX(3 cc,60 mg)固相萃取凈化柱(美國Waters公司)；乙腈、甲醇(色譜純，德國默克公司)；甲酸、氨水(色譜純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為經(jīng)Milli-Q 超純水器純化的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取乙烯利標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g(精確至0.1 mg)，以甲醇溶解并定容至50 mL，配制194 mg/L乙烯利標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。用甲醇稀釋至97 mg/L，再分別用甲醇、棉籽、棉葉和土壤3種不同空白基質(zhì)提取液逐級(jí)稀釋，配制成0.02、0.097、0.194、0.97、1.94 mg/L乙烯利系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

提取：準(zhǔn)確稱取各類樣品(棉籽、棉葉、土壤) 5 g于50 mL離心管中，加入25 mL甲醇-1%甲酸(70∶30，體積比)提取液，渦旋提取2 min，4 000 r/min條件下離心5 min。移出5 mL提取液待凈化。

凈化：Oasis MAX(3 cc,60 mg)固相萃取小柱經(jīng)3 mL甲醇和3 mL水活化后，將5 mL提取液上樣并用3 mL甲醇淋洗，棄去淋出液，用6 mL含2%甲酸的甲醇洗脫后，洗脫液在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)濃縮并氮吹至干，用流動(dòng)相定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.4 儀器檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱為Waters CORTECS HILIC(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)超高效液相色譜柱，流動(dòng)相為0.01%氨水溶液-乙腈(80∶20，體積比)，流速0.2 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式為ESI-，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；Interface volta為4 kV，霧化氣流速為3.0 L/min，干燥氣流速為10.0 L/min，加熱氣流速為10.0 L/min，Interface 溫度為300 ℃，脫溶劑管溫度為250 ℃，Heat Block溫度為400 ℃；碰撞能量為-22 eV和-25 eV(碰撞氣為Ar)，駐停時(shí)間為100 ms，母離子m/z143，子離子m/z107(定量)，子離子m/z79(定性)。

1.5 實(shí)際樣品的制備

2017 年在浙江和山東 2 地對(duì)棉花田施用75%乙烯利水劑，小區(qū)面積30 m2，劑量為1 687.5 g a.i./ha，處理重復(fù)3次，另設(shè)清水空白對(duì)照。施藥后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d采集棉葉和土壤樣品，最后一次同時(shí)采集棉籽樣品，采集的樣品切碎、研磨、混勻后貯存于-20 ℃冰柜中待測(cè)。

圖1 不同提取溶劑對(duì)乙烯利的提取效率Fig.1 Extraction efficiencies of ethephon with different solvents

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

合適的提取溶劑是保證目標(biāo)組分回收率的關(guān)鍵，通常情況下，提取溶劑的選取需要依據(jù)目標(biāo)組分的物化性質(zhì)及樣品的類型來確定[19]。常用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的提取劑主要有乙腈、甲醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯等[20]。根據(jù)乙烯利的溶解度特性和樣品的性質(zhì)，在0.194 mg/kg加標(biāo)水平條件下，乙腈、甲醇和甲醇-1%甲酸(70∶30，體積比)混合提取液對(duì)3種基質(zhì)的提取效率見圖1。結(jié)果表明，乙腈對(duì)3種基質(zhì)中乙烯利的提取效率最低(17%～26%)，Xie等[16]采用乙腈提取棉花樣品時(shí)未檢出乙烯利，說明乙腈不適于作為乙烯利在多數(shù)樣品中的提取溶劑；用甲醇作提取溶劑時(shí)，土壤中乙烯利的提取效率為75%，基本滿足要求，但對(duì)棉籽和棉葉中乙烯利的提取效率較差(分別為57%和48%)；以甲醇-1%甲酸(70∶30)二元混合提取液作為提取溶劑時(shí)，乙烯利在3種基質(zhì)中的提取效率較高(85%～92%)，且共提出的雜質(zhì)較少。因此，本實(shí)驗(yàn)選用甲醇-1%甲酸(70∶30)混合提取液作為3種不同基質(zhì)中乙烯利殘留的提取溶劑。

2.2 SPE小柱的選擇

乙烯利是帶有磷酸根并具有強(qiáng)極性的二元酸(pKa=2.5和7.2)[18]，根據(jù)乙烯利的物化特性，選取并比較了適用于酸堿和中性農(nóng)藥的Oasis HLB、強(qiáng)酸性農(nóng)藥的Oasis WAX和酸性農(nóng)藥的Oasis MAX 3種凈化柱對(duì)棉籽、棉葉及土壤基質(zhì)中乙烯利的凈化效果，以含2%甲酸的甲醇作為洗脫劑。結(jié)果表明，在0.194 mg/kg 加標(biāo)水平下，Oasis MAX小柱對(duì)3種基質(zhì)的凈化效果最好，且回收率較高(82%～91%)；Oasis HLB小柱對(duì)3種基質(zhì)的凈化效果也較好，但乙烯利的回收率較低(65%～72%)；而Oasis WAX小柱對(duì)乙烯利的回收率最低(43%～50%)。這可能與Oasis MAX小柱的填料性質(zhì)有關(guān)，其填料為弱陰離子吸附劑(pKa=6.0)。因此本研究選用Oasis MAX作為不同基質(zhì)提取液的凈化小柱。

2.3 流動(dòng)相的選擇

在棉籽中添加0.194 mg/kg乙烯利水平下，按照優(yōu)化的樣品前處理方法，分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.01%氨水和乙腈-0.05%氨水作為流動(dòng)相體系時(shí)對(duì)乙烯利的分離效果和響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果表明，以乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相時(shí)，乙烯利的峰形差，且響應(yīng)值很低(圖2A和圖2B)；以乙腈-0.01%氨水作為流動(dòng)相時(shí)，響應(yīng)值較好，但峰形拖尾，且乙烯利的保留時(shí)間漂移(圖2C)；以乙腈-0.05%氨水作為流動(dòng)相時(shí)，乙烯利峰形和響應(yīng)值均較好，且基線平穩(wěn)，保留時(shí)間合適(圖2D)。綜合考慮，最終選擇乙腈-0.05%氨水作為乙烯利檢測(cè)分析的流動(dòng)相。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

使用1.94 mg/L的乙烯利標(biāo)準(zhǔn)溶液，在連接兩通的條件下，流動(dòng)相組成為0.01%氨水溶液和乙腈(50∶50，體積比)，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣體積1 μL，分別用電噴霧電離正離子模式( ESI+)和電噴霧電離負(fù)離子模式( ESI-)進(jìn)行母離子全掃描，掃描范圍m/z為100～500。結(jié)果表明：在負(fù)離子模式下(ESI-)，乙烯利的電離效果最佳，信號(hào)強(qiáng)度高于正離子模式，獲得m/z143的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)乙烯利的[M-H]-進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描得到碎片離子，選擇m/z143/107 和m/z143/79分別為定量和定性離子對(duì)，當(dāng)碰撞能量為 -22 eV 時(shí)，碎片離子m/z107的響應(yīng)值大于m/z79，因此選擇m/z107作為定量離子。

圖3 乙烯利在溶劑和各基質(zhì)提取液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curves of ethephon in solvent and matrix-matched extracts

2.5 基質(zhì)效應(yīng)分析

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)農(nóng)藥殘留時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect，ME)是經(jīng)常遇到的問題，在樣品提取凈化過程中共流出的雜質(zhì)可增強(qiáng)或抑制目標(biāo)組分的離子化效率，從而導(dǎo)致檢測(cè)誤差[21]。一般情況下，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值增加或減少的百分比來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，計(jì)算公式為ME=(a-b)/a×100%(a和b分別為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)。當(dāng)|ME|<20%時(shí)表示基質(zhì)效應(yīng)較小，可采用溶劑標(biāo)定；當(dāng)20%≤|ME|≤50%時(shí)表示基質(zhì)效應(yīng)較大，應(yīng)考慮采用基質(zhì)標(biāo)定；當(dāng)|ME|>50%時(shí)表示基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)，需繼續(xù)優(yōu)化樣品前處理方法以降低基質(zhì)效應(yīng)[22]。本研究采用溶劑和各基質(zhì)提取凈化液分別配制乙烯利的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，在已確定的儀器條件下進(jìn)樣，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，乙烯利在0.02～1.94 mg/L范圍內(nèi)，在溶劑及各基質(zhì)提取液中的線性關(guān)系良好(圖3)，r2≥0.996 3，計(jì)算得到乙烯利在棉籽、棉葉和土壤中的基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)分別為13.4%、7.2%和-17.4%，各基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)的絕對(duì)值均小于20%，因此本研究采用溶劑標(biāo)匹配外標(biāo)法對(duì)乙烯利進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

2.6 線性范圍、檢出限與定量下限

在優(yōu)化條件下，考察乙烯利的線性關(guān)系，結(jié)果顯示，乙烯利的峰面積與其質(zhì)量濃度在0.02～1.94 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=2.79×106x+2.11×104(r2=0.998 3)。以最低添加水平的信噪比S/N≥3作為方法的檢出限(LOD)，S/N≥10作為方法的定量下限(LOQ)，測(cè)得乙烯利在棉籽、棉葉和土壤3種基質(zhì)中的LOD和LOQ分別為0.01 mg/kg和0.02 mg/kg。

表1 乙烯利在棉籽、棉葉和土壤空白樣品中的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 1 Recoveries and RSDs of ethephon in cotton seed,cotton leaf and soil(n=5)

2.7 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在優(yōu)化條件下，采用棉籽、棉葉和土壤空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每種基質(zhì)分別加標(biāo)0.02、0.194和3.88 mg/kg 3個(gè)水平，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)5次。結(jié)果表明：乙烯利在3種基質(zhì)中的回收率為78.3%～95.1%，RSD為1.9%～5.2%，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合NY/T788-2004《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》的要求[23]。

2.8 方法應(yīng)用

采用本文建立的方法對(duì)浙江省和山東省2個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)施用乙烯利的棉田樣品進(jìn)行檢測(cè)(表2)。結(jié)果表明：在2地的棉籽樣品中均未檢出乙烯利；浙江點(diǎn)的棉葉中乙烯利的檢出范圍為0.22～31 mg/kg，消解規(guī)律符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，Ct=22.028 3e-0.170 1t，降解半衰期為4.1 d；山東點(diǎn)的棉葉中乙烯利的檢出范圍為0.23～22 mg/kg，消解規(guī)律符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，Ct=19.577 6e-0.228 0t，降解半衰期為3.0 d；浙江點(diǎn)的土壤中乙烯利檢出范圍為0.17～8.9 mg/kg，消解動(dòng)力學(xué)方程為Ct=8.270 6e-0.125 2t，消解半衰期為5.5 d；山東點(diǎn)的土壤中乙烯利檢出范圍為0.19～4.0 mg/kg，消解動(dòng)力學(xué)方程為Ct=3.484 1e-0.134 2t，消解半衰期為5.2 d。從檢測(cè)結(jié)果看，乙烯利在棉葉和土壤中的消解速率較快，施藥后28 d時(shí)其殘留量已很低。

表2 乙烯利在棉葉和土壤中的殘留量Table 2 Content of ethephon residues in cotton leaf and soil w/(mg·kg-1)

3 結(jié) 論

本研究采用固相萃取(Oasis MAX凈化柱)樣品前處理方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)，以及負(fù)離子和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，建立了棉籽、棉葉和土壤中乙烯利殘留的檢測(cè)方法。在優(yōu)化條件下，乙烯利在棉籽、棉葉和土壤中的回收率為 78.3%～95.1%，RSD為 1.9%～5.2%，3種基質(zhì)中的LOQ均為 0.02 mg/kg，方法的靈敏度符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。通過對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)，表明所建方法具有操作簡單、提取試劑毒性較低、重復(fù)性好、靈敏度高等特點(diǎn)，適用于棉籽中乙烯利殘留的抽檢監(jiān)測(cè)及該藥的殘留登記試驗(yàn)。