液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物殘留量

余瑋玥，黃冬梅，史永富，孔 聰，田良良，韓 峰，張政權(quán)

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090)

亮綠(Brilliant green,BG)屬于三苯甲烷類染料，與孔雀石綠的分子結(jié)構(gòu)式相似。亞甲基藍(lán)(Methylene blue，MB) 又名次甲基藍(lán)、堿性湖藍(lán)，屬于人工合成的噻嗪類染料，最早應(yīng)用于治療細(xì)菌性痢疾[1]?？兹甘G因具有高毒、高殘留以及致癌、致突變等特點(diǎn)[2]，已被許多國(guó)家禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用，而有些養(yǎng)殖戶將亮綠及亞甲基藍(lán)作為替代品使用。亮綠具有抗微生物、抗寄生蟲(chóng)和抗真菌特性，但同時(shí)也有一定的毒性，具有致突變和致癌作用，會(huì)影響水生生物和人類的健康[3-4]。亞甲基藍(lán)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中可用于治療淡水魚(yú)類的小爪蟲(chóng)病、紅嘴病、斜管蟲(chóng)病等，也可用作消毒劑降低存養(yǎng)池中的微生物量[5]。亞甲基藍(lán)在生物體中經(jīng)過(guò)代謝，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其代謝產(chǎn)物分別為天青A(Azure A，AZA)、天青B(Azure B，AZB)和天青C(Azure C，AZC)。高濃度的亞甲基藍(lán)對(duì)水生生物有毒性甚至致其死亡[6]，并會(huì)通過(guò)食物富集作用對(duì)人體造成危害，因此需要建立水產(chǎn)品中亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物殘留量的檢測(cè)方法。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物殘留的檢測(cè)方法有分光光度法[7-8]、毛細(xì)管電泳法[9-10]、電化學(xué)法[11-12]、液相色譜法[13-14]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-17]等。其中液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用較多，但液相色譜法可能因樣品中干擾物質(zhì)的存在導(dǎo)致定性不準(zhǔn)確，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)器的靈敏度較高，能提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，可通過(guò)母離子、子離子等信息進(jìn)行確證，從而提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性[18]。目前同時(shí)檢測(cè)亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物的方法報(bào)道較少，且尚未建立水產(chǎn)品中亮綠、天青A、天青B和天青C同時(shí)檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。侯建波等[15]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，以MCAX柱凈化，需使用2種洗脫液，洗脫過(guò)程繁瑣且前處理時(shí)間長(zhǎng)?；菔|華等[19]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定孔雀石綠、結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)等6種陽(yáng)離子染料，但未檢測(cè)亮綠及亞甲基藍(lán)代謝物。Tarbin等[20]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)亮綠、亞甲基藍(lán)及天青B進(jìn)行檢測(cè)，檢出限分別為1.1、14.0、6.2 μg/kg。本實(shí)驗(yàn)建立了水產(chǎn)品中亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物同時(shí)檢測(cè)的方法，采用PRS固相萃取柱，僅用1種洗脫液即可完全洗脫目標(biāo)物，有效縮短了前處理時(shí)間，且靈敏度較好，適用性強(qiáng)，能滿足水產(chǎn)品中藥物殘留的檢測(cè)要求，為制定水產(chǎn)品中亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物殘留量的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher 公司)；16RⅫ 高速冷凍離心機(jī)(日本 Hitachi CF公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore 公司)；VisiprepTMDL固相萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)；BT 423S電子精密天平(Sartorius公司)；Genius 3 旋渦混合器(德國(guó) IKA 公司)；KQ-300E超聲波提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)；V-700 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士Buchi公司)；N-EVAPTM112型氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)；ST3100 pH計(jì)(奧豪斯儀器(常州)有限公司)；Bond Elut PRS固相萃取柱(500 mg/3 mL，美國(guó)Agilent 公司)。

亮綠(純度96%，德國(guó)Dr.Ehrensorfer公司)；亞甲基藍(lán)(98%，美國(guó)Fluka公司)；天青A(80%)、天青C(50%)(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)；天青B(98%，美國(guó)Sigma公司)；乙腈、甲醇、二氯甲烷(J.T.Baker公司)，甲酸(Fluka公司)，乙酸銨(Aladdin公司)均為HPLC級(jí)；鹽酸羥胺、對(duì)甲苯磺酸、二甘醇均為分析純；洗脫液為0.1 mol/L乙酸銨(pH 4.5)-乙腈(1∶1，體積比)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取亮綠、亞甲基藍(lán)、天青A、天青B、天青C標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg(精確至0.000 1 g)，分別用甲醇溶解，并定容至100 mL容量瓶中，配制成100 mg/L 的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于-18 ℃棕色玻璃瓶中保存，有效期6個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確移取適量100 mg/L單標(biāo)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成亮綠、亞甲基藍(lán)、天青A、天青B、天青C均為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃棕色玻璃瓶中保存，有效期3個(gè)月。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取稱取2.0 g試樣(精確至0.01 g)于30 mL塑料離心管中，加入250 g/L鹽酸羥胺 1 mL、0.5 mol/L對(duì)甲苯磺酸 2.5 mL、0.1 mol/L乙酸銨(pH 4.5)5 mL和乙腈10 mL，渦旋混勻1 min，50 ℃下超聲提取15 min。于5 ℃下高速離心(10 000 r/min)10 min，移取上清液至50 mL塑料離心管中，殘?jiān)儆?0 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并上清液，混勻，待凈化。

1.3.2凈化向塑料離心管中加入2 mL二甘醇和20 mL二氯甲烷，渦旋混勻1 min，靜置30 min，6 000 r/min離心10 min，下層溶液轉(zhuǎn)移至50 mL雞心瓶中，上層溶液中加入5 mL乙腈和15 mL二氯甲烷進(jìn)行萃取，合并下層溶液，濃縮至2 mL左右。加入5 mL乙腈溶解，渦旋混勻1 min，超聲5 min。將溶液過(guò)經(jīng)5 mL乙腈活化的PRS固相萃取柱，以2 mL水和2 mL甲醇依次淋洗并減壓抽干，加入5 mL洗脫液洗脫，收集洗脫液于40 ℃下氮吹至3 mL(若低于3 mL，則用乙腈定容至3 mL)，過(guò)0.22 μm濾膜后，待測(cè)。

1.4 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18柱(2.0 mm×100 mm，3 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：25 μL；流動(dòng)相：A為2 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)，B為乙腈，C為甲醇。梯度洗脫程序：0～1.0 min，80%A，10%B；1.0～8.0 min，80%～5%A，10%～45%B；8.0～10.0 min，5%A，45%B；10.0～10.1 min，5%～80%A，45%～10%B；10.1～14.0 min，80%A，10%B。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；檢測(cè)方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM)；掃描方式：正離子模式；噴霧電壓：3 500 V；鞘氣壓力：20 kPa；輔助氣壓力：10 kPa；離子傳輸毛細(xì)管溫度：320 ℃。亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物的母離子、子離子和碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of brilliant green,methylene blue and its metabolites

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇文獻(xiàn)顯示[19,21]，C18填料的色譜柱可對(duì)亮綠、亞甲基藍(lán)、天青A、天青B和天青C進(jìn)行有效分離。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了粒徑分別為3 μm和5 μm的CAPCELL PAK C18色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)粒徑為3 μm的色譜柱柱效高于5 μm色譜柱，天青C在粒徑為5 μm的色譜柱上出峰時(shí)間為3.87 min，比3 μm色譜柱上的出峰時(shí)間提前1 min左右，且目標(biāo)峰附近有干擾。因此，選擇粒徑為3 μm的CAPCELL PAK C18柱，可實(shí)現(xiàn)5種化合物的良好分離。

2.1.2流動(dòng)相的優(yōu)化對(duì)水產(chǎn)品中漁藥、獸藥殘留進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，一般選用乙腈、甲醇和水作為流動(dòng)相，并在流動(dòng)相中加入甲酸提高離子化效率,加入乙酸銨改善峰形、減少拖尾[22]。分別考察了0.1%甲酸-乙腈、2 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈和2 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈-甲醇3種流動(dòng)相的分離效果，發(fā)現(xiàn)以0.1%甲酸-乙腈或2 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈為流動(dòng)相時(shí)，天青C的峰形不穩(wěn)定且拖尾嚴(yán)重。甲醇因極性較大可將目標(biāo)物更好地從色譜柱上洗脫，因此流動(dòng)相中加入甲醇后天青C的峰形得到改善，其余4種目標(biāo)化合物均能較好分離且峰形尖銳。圖1為最優(yōu)條件下亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物的提取離子流圖。

圖2 不同提取溶劑對(duì)5種化合物回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction solvents on recoveries of five compounds

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑與萃取溶劑的選擇亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物易溶于乙腈、甲醇、水等溶液，而水產(chǎn)品的基質(zhì)復(fù)雜，含有大量脂肪和蛋白質(zhì)，由于乙腈具有沉淀蛋白的作用[23]，因此選擇乙腈作為主要的提取溶劑?？疾炝艘译?、乙腈-乙酸乙酯、乙腈-二氯甲烷、乙腈-乙酸銨緩沖溶液(鹽酸羥胺、對(duì)甲苯磺酸和乙酸銨溶液)的提取效果(圖2)，發(fā)現(xiàn)以乙腈、乙腈-乙酸乙酯或乙腈-二氯甲烷為提取溶劑時(shí)，亮綠和天青C的回收率僅為50%左右，而用乙腈-乙酸銨緩沖溶液提取可有效提高回收率。這是因?yàn)樘崛∪軇┲屑尤臌}酸羥胺可防止目標(biāo)物被氧化[24]。此外，由于5種化合物均為陽(yáng)離子型化合物，選擇對(duì)甲苯磺酸作為離子對(duì)試劑，在酸性環(huán)境下可與目標(biāo)物形成離子對(duì)，使其更易被有機(jī)試劑提取[25]。因此，最終選擇乙腈-乙酸銨緩沖溶液作為提取溶劑。

為更有效去除水產(chǎn)品中的雜質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用二氯甲烷作為萃取溶劑進(jìn)行液液萃取凈化，利用化合物在兩種互不相溶(或微溶)的溶劑中溶解度或分配系數(shù)的差異，使化合物從一種溶劑轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中。實(shí)驗(yàn)中加入乳化劑二甘醇，可使水相和有機(jī)相混合均勻，有利于二氯甲烷將水中的乙腈萃取完全，在旋蒸過(guò)程中也可防止爆沸[26]。此外，進(jìn)行第二次反萃取時(shí)加入乙腈作為介質(zhì)可提高萃取效率[13]。

2.2.2固相萃取柱的選擇亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物均為陽(yáng)離子型化合物，因此考察了N-丙基乙二胺固相萃取柱(PSA)、HLB柱和丙磺酸固相萃取柱(PRS)對(duì)目標(biāo)物的吸附和凈化作用。結(jié)果表明，通過(guò)型萃取柱PSA柱對(duì)天青C的吸附較大，回收率為60%左右，其余目標(biāo)化合物的回收率為77.1%～87.1%；HLB柱采用乙酸銨上樣，甲醇洗脫，天青C的回收率僅為40%左右，其他目標(biāo)化合物的回收率為75.9%～96.2%，并且HLB柱對(duì)雜質(zhì)的凈化效果差，樣液較渾濁；而PRS柱是以硅膠為基質(zhì)的強(qiáng)陽(yáng)離子交換萃取柱，鍵合官能團(tuán)為丙基磺酸，其不僅能將5種目標(biāo)化合物吸附，并且采用乙腈-0.1 mol/L乙酸銨(pH 4.5，1∶1)混合溶液能將其完全洗脫，回收率均在90%以上，且凈化后溶液澄清。因此實(shí)驗(yàn)選用PRS柱進(jìn)行固相萃取。

實(shí)驗(yàn)對(duì)洗脫液用量(2、3、5 mL)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫液用量少時(shí)不能將目標(biāo)物完全洗脫。洗脫液用量為3 mL時(shí)，亞甲基藍(lán)的回收率僅為35.6%；洗脫液用量為5 mL時(shí)可將所有化合物完全洗脫，且回收率均高于90%，因此選擇洗脫液用量為5 mL。

2.2.3濃縮體積的優(yōu)化試驗(yàn)過(guò)程中，萃取所得溶液需要旋蒸濃縮，但旋蒸至干時(shí)某些化合物有損失，亮綠、天青A和天青C的回收率分別為69.5%、52.2%和79.2%，因此選擇將溶液旋蒸至約2 mL，以減少損失。收集的固相萃取柱洗脫液氮吹濃縮時(shí)也會(huì)導(dǎo)致?lián)p失，天青A和天青B的回收率僅分別為46.3%、52.9%，考慮到洗脫液中有水分較難吹干，因此最終選擇氮吹濃縮至3 mL。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的研究

基質(zhì)效應(yīng)是樣品基質(zhì)中含有的內(nèi)源性化合物影響液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的現(xiàn)象[27]。其計(jì)算公式為：基質(zhì)效應(yīng)=(1-基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%[28]。結(jié)果表明，樣品基質(zhì)對(duì)5種目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)為40.1%～75.3%。由于存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，因此本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線以減少基質(zhì)干擾，提高樣品定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 方法有效性評(píng)價(jià)

2.4.1線性范圍、檢出限及定量下限以空白基質(zhì)溶液配制1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用本方法進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(X，μg/L)為橫坐標(biāo)，各化合物定量離子的色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。選取空白鯽魚(yú)作為樣品基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/kg，按照本方法提取凈化后進(jìn)行分析，以不低于3倍信噪比(S/N≥3)且滿足方法準(zhǔn)確度要求時(shí)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度為檢出限(LOD)，以S/N≥10對(duì)應(yīng)的濃度為定量下限(LOQ)[29]。亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r2>0.999)，LOD均為1.0 μg/kg，LOQ均為2.0 μg/kg(表2)。

2.4.2回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以陰性鯽魚(yú)為樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平為1.0、5.0、10.0 μg/kg，每個(gè)加標(biāo)濃度平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率及批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物的平均回收率為70.3%～92.1%，RSD為2.3%～13%(表2)。本方法的準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足微量分析的要求。

表2 亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物的線性范圍、方法檢出限、定量下限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Linear ranges,LODs,LOQs,recoveries and relative standard deviations of brilliant green,methylene blue and their metabolites

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

將已建立的方法應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，在上海江楊農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)抽取的鯽魚(yú)、大黃魚(yú)、南美白對(duì)蝦和大閘蟹24個(gè)樣品中均未檢出目標(biāo)化合物。另采用該方法對(duì)本課題組開(kāi)展的藥代實(shí)驗(yàn)中取得的陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)定，以200 μg/L的亮綠溶液對(duì)體重為200～300 g的鯽魚(yú)進(jìn)行藥浴實(shí)驗(yàn)。于不同時(shí)間收集鯽魚(yú)樣品，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3條鯽魚(yú)，利用本方法進(jìn)行檢測(cè)。某時(shí)間點(diǎn)測(cè)得3條鯽魚(yú)肌肉中亮綠的含量分別為31.3、35.9、30.3 μg/kg，其他實(shí)驗(yàn)室采用本方法對(duì)該樣品的檢測(cè)結(jié)果分別為30.5、34.7、29.3 μg/kg，與本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果較一致。

3 結(jié) 論

本文利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了水產(chǎn)品中亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物殘留的同時(shí)檢測(cè)方法，通過(guò)使目標(biāo)化合物形成離子對(duì)提高了提取效率，采用二氯甲烷液液萃取和PRS固相萃取柱相結(jié)合的方法凈化樣品，有效去除了雜質(zhì)，降低了干擾。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，5種化合物在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限均為1.0 μg/kg，定量下限均為2.0 μg/kg；回收率為70.3%～92.1%，RSD為2.3%～13%。將該方法應(yīng)用于藥代實(shí)驗(yàn)中實(shí)際陽(yáng)性樣品的檢測(cè)，與其他實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果一致。該方法準(zhǔn)確度高、實(shí)用性強(qiáng)，能滿足實(shí)際樣品中亮綠、亞甲基藍(lán)及其代謝物的檢測(cè)要求。