超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜快速篩查與確證生鮮牛乳中80種抗生素和激素

貢松松,張 婧，嚴(yán) 鳳，吳劍平,潘 娟，顧 欣

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

近年來，不斷出現(xiàn)的食品安全問題日益受到人們的關(guān)注。牛奶作為一種老少皆宜的營養(yǎng)食品，其安全問題尤為突出，而抗生素和激素殘留已成為牛奶安全問題中較嚴(yán)重的一種。歐盟對獸藥殘留限量均作了嚴(yán)格規(guī)定[1]。我國為加強(qiáng)獸藥殘留監(jiān)控和保障動物性食品安全衛(wèi)生，也對獸藥最高殘留限量作了嚴(yán)格規(guī)定[2]。

抗生素是微生物在代謝過程中產(chǎn)生的一種對其他微生物具有殺滅或抑制作用的次級代謝產(chǎn)物，其廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)和獸醫(yī)臨床診斷以及呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)感染的治療[3]。隨著抗生素的大面積使用，加之養(yǎng)殖戶趨利心理和法律意識淡薄，不遵守休藥期、擅自加大用量等，導(dǎo)致抗生素殘留日益嚴(yán)重[4]。激素是由體內(nèi)特定器官產(chǎn)生，通過血液運(yùn)輸?shù)狡渌鞴俨⒁詷O其微小的量來產(chǎn)生調(diào)節(jié)生物體代謝、平衡作用的生理化學(xué)物質(zhì)的總稱[5]。激素作為促生長劑使用時(shí)可提高動物的生長率，然而其對人、動物和環(huán)境具有很多潛在危害，更有致癌風(fēng)險(xiǎn)。歐盟96/22/EC指令、美國食品藥物管理局(FDA)規(guī)定禁止在食品源性動物中使用激素類藥物，我國農(nóng)業(yè)部第235公告也對此作了詳細(xì)規(guī)定[2,6]。面臨嚴(yán)峻的食品安全形勢，開發(fā)出高效、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法顯得尤為迫切。

獸藥多殘留的前處理技術(shù)主要有液-液萃取[7-9]、固相萃取[10]、基質(zhì)固相分散技術(shù)[11-12]以及QuEChERS[13-14]等。其中QuEChERS原本應(yīng)用于農(nóng)殘領(lǐng)域[15]，因其快速、簡便、安全、有效等特點(diǎn)，在獸藥殘留領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用[16-17]。獸藥多殘留的檢測方法主要有GC[18]、GC-MS[19]、HPLC[20]、LC-MS/MS[21-23]，以及應(yīng)用日益增多的高分辨質(zhì)譜(如Orbitrap、TOF等)[24-25]。GC和LC方法由于本身檢測器的局限，定性能力不足，多獸殘篩查領(lǐng)域應(yīng)用有限。而LC-MS法因具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、分析速度快等優(yōu)勢而在獸藥殘留分析中得到廣泛應(yīng)用，已有的國家標(biāo)準(zhǔn)多數(shù)是針對某一類獸藥進(jìn)行檢測[26-28]。目前國內(nèi)對于單類抗生素或激素的檢測方法已日漸成熟，但同時(shí)檢測抗生素和激素因存在種類多、性質(zhì)差異大等挑戰(zhàn)而研究相對較少。本文參考相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)[2,13-14,29]，比較了超濾膜和QuEChERS在多殘留前處理方面的優(yōu)劣勢，并最終采用改良的QuEChERS方法，結(jié)合以四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜為代表的高分辨質(zhì)譜技術(shù)，建立了生鮮牛乳中80種抗生素和激素的篩查和檢測方法。該方法不僅縮短了檢測時(shí)間，而且提高了定性結(jié)果的準(zhǔn)確度，從而實(shí)現(xiàn)了對生鮮牛乳中多種類抗生素和激素的快速篩查與定性確證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、藥品與材料

乙腈(色譜純，美國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；乙酸(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑公司)；無水硫酸鈉、氯化鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷(ODS C18)(美國Agilent公司)；超濾離心管(3 kD，美國Millipore公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(Milli-Q自制)。

抗生素、激素標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司和美國Sigma公司；所有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度：90.0%～99.9%；80種抗生素和激素標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)信息見表1。

表1 80種抗生素和激素的保留時(shí)間、理論分子量、實(shí)測分子量、質(zhì)量誤差以及質(zhì)譜碎片離子Table 1 Retention times，theoretical masses，experimental masses，mass errors and MS fragmentat ions of 80 antibiotics and hormones

(續(xù)表1)

No. CompoundRetentiontime(min)Theoretical mass(m/z)Experimentalmass(m/z)Mass error(ppm)Fragment ions(m/z)8Methyltestosterone(甲基睪酮)9.651303.231 9303.231 6-1.07285.220 4,267.209 4,189.163 5,109.064 59Stanozolol(司坦唑醇)9.609329.258 7329.258 1-1.97287.199 6,269.188 4,135.116 9,121.064 310Mesterolone(美睪酮)10.024305.247 5305.247 3-4.44285.221 0,173.131 8,109.064 7,97.064 711Progesterone(孕酮)11.135315.231 9315.231 91.12297.220 1,255.209 9,123.080 1,109.064 512Medroxyprogesterone acetate(甲羥孕酮乙酸酯)10.945387.253 0387.251 0-4.64327.229 9,285.219 7,267.209 4,123.079 913Norethindrone(炔諾酮)8.995299.200 6299.200 40.96281.189 2,231.172 8,119.085 5,109.064 61417α-Hydroxyprogesterone acetate(17α-醋酸羥基孕酮)10.472373.237 3373.237 1-0.61313.216 4,281.247 5,227.128 0,158.153 815Megestrol acetate(醋酸甲地孕酮)10.845385.237 3385.237 00.61325.215 4,267.173 5,224.154 8,105.069 516Melengestrol acetate(醋酸美侖孕酮)11.003397.237 3397.237 30.64315.231 7,279.159 6,205.086 5,149.023 317Norgestrel(炔諾孕酮)10.853325.216 2325.216 40.56322.270 2,279.158 8,194.120 4,140.071 318D(minus)-norgestrel(左炔諾孕酮)9.891313.216 2313.216 20.60309.173 0,236.106 0,209.164 6,99.008 519Chlormadinone acetate(醋酸氯地孕酮)10.654405.182 7405.182 3-1.23385.235 8,301.133 9,267.173 4,105.069 620Triamcinolone(曲安西龍)6.034395.186 4395.186 4-0.13375.179 5,194.115 7,172.133 1,144.138 121Cortisone(可的松)6.723361.201 0361.201 41.55343.189 8,163.111 1,121.063 7,107.085 422Prednisolone(潑尼松龍)6.642361.201 0361.201 41.55343.190 8,171.149 1,144.138 2,118.086 123Betamethasone(倍他米松)7.194393.207 2393.206 7-1.17373.201 1,171.148 6,144.138 2,121.050 924Dexamethasone(地塞米松)7.212393.207 2393.206 7-1.17373.199 3,355.189 8,237.126 1,147.079 225Hydrocortisone(氫化可的松)6.681363.216 6363.215 91.2343.190 1,171.080 5,147.080 1,121.064 226F1umethasone(氟米松)7.121411.197 8411.197 5-0.49343.189 6,282.278 8,171.148 4,144.138 027Methylprednisolone(甲基潑尼松龍)7.071375.216 6375.215 4-2.24357.204 4,339.194 1,161.095 4,135.080 028Amoxicillin(阿莫西林)4.607366.111 8366.111 90.01349.084 9,208.042 9,134.059 2,114.000 329Ampicillin(氨芐西林)5.142350.116 9350.117 00.28333.088 7,192.047 3,160.042 1,106.065 130Cefradine(頭孢拉定)5.163350.116 9350.117 00.28176.070 2,158.026 3,140.016 0,108.080 231Penicillin Ⅴ(青霉素Ⅴ)7.175351.100 9351.100 71.06192.065 2,160.042 2,126.037 2,114.036 832Oxacillin(苯唑西林)7.486402.111 8402.111 6-0.64338.219 4,280.176 9,237.159 9,187.111 333Cloxacillin(氯唑西林)7.834436.072 8436.072 8-1.19277.036 4,178.004 9,160.041 7,114.036 934Nafcillin(奈夫西林)8.025415.132 2415.131 5-1.51371.181 6,253.123 6,121.063 9,107.084 535Cephalexin(頭孢氨芐)5.317348.101 3348.100 9-0.86174.054 4,158.026 9,140.016 1,106.065 136Penicillin G(青霉素G)5.467335.106 0335.105 8-0.29189.069 2,176.070 2,160.042 1,114.036 837Cefazolin(頭孢唑啉)5.649455.037 3455.036 9-0.82350.117 0,335.105 8,172.133 1,158.027 038Cefoperazone(頭孢哌酮)5.865646.149 7646.149 1-0.89455.036 2,194.116 4,176.072 2,158.026 739Azithromycin(阿奇霉素)5.611749.515 8749.515 3-0.8591.421 2,422.266 1,375.265 8,172.133 140Tylosin(泰樂菌素)6.756916.526 4916.525 4-1.04772.446 7,318.188 8,174.111 6,101.059 341Tilmicosin(替米考星)5.943869.573 3869.573 40.92749.516 8,435.293 0,422.267 0,375.265 642Spiramycin(螺旋霉素)5.545843.521 3843.520 5-0.94591.421 3,422.266 0,375.265 7,296.214 843Tiamulin(泰妙菌素)7.452494.329 9494.329 0-1.58435.290 5,363.725 0,192.105 5,144.138 244Roxithromycin(羅紅霉素)7.701837.531 8837.532 50.22679.437 8,494.335 5,419.270 4,279.159 045Josamycin(交沙霉素)8.207828.474 0828.472 2-2.28573.373 7,494.333 8,419.270 8,366.237 546Sulfamethazine(磺胺二甲嘧啶)5.802279.091 0279.090 8-0.28213.112 6,186.032 5,156.010 6,108.044 147Sulfadiazine(磺胺嘧啶)5.271251.059 7251.059 6-0.55214.091 5,184.086 3,156.010 9,108.044 148Sulfadimethoxine(磺胺二甲氧嘧啶)6.656311.080 9311.081 41.84293.101 2,255.124 3,209.116 5,108.044 149Sulfathiazloe(磺胺噻唑)5.312256.020 9256.020 8-0.65214.092 8,156.010 6,108.044 7,101.016 750Sulfapyridine(磺胺吡啶)5.445250.064 5250.064 2-4.12199.097 5,156.010 7,108.044 1,101.016 251Sulfachloropyridazine(磺胺氯噠嗪)6.092285.020 8285.021 31.17217.105 2,156.087 4,130.014 3,108.044 252Sufamerazine(磺胺甲嘧啶)5.586265.075 4265.074 90.31234.134 1,186.034 2,156.010 8,108.044 553Sulfacetamide(磺胺醋酰)5.055215.048 5215.048 60.46156.011 2,108.044 6,92.049 6,65.038 754Sulfatroxazole(磺胺曲沙唑)5.594268.075 0268.074 8-0.85173.018 8,157.013 2,108.044 2,92.049 455Sulfaphenazole(磺胺苯吡唑)6.747315.091 0315.091 10.71222.032 2,160.085 8,140.015 6,92.049 956Sulfabenzamide(磺胺苯甲酰)6.615277.064 1277.064 20.01156.010 9,108.044 4,80.049 9,65.038 857Sulfamethizole(磺胺甲噻二唑)5.702271.031 8271.031 6-0.5156.011 9,108.044 4,92.049 7,65.039 258Sulfamethoxypyridazine(磺胺甲氧噠嗪)5.744281.070 3281.073 24.65186.031 1,156.011 2,124.086 3,92.049 659Sulfamethoxazole(磺胺甲唑)6.241254.059 4254.059 20.02188.081 8,147.078 9,92.049 6,65.039 060Marbofloxacin(馬波沙星)5.246363.146 3363.148 74.58341.149 7,286.098 3,203.061 2,84.080 561Fleroxacin(氟羅沙星)5.321370.137 3370.137 1-1.02352.146 9,342.160 4,321.137 0,152.067 062Enoxacin(依諾沙星)5.213321.135 7321.136 14.14224.127 7,180.589 8,161.072 3,152.067 1

(續(xù)表1)

No. CompoundRetentiontime(min)Theoretical mass(m/z)Experimentalmass(m/z)Mass error(ppm)Fragment ions(m/z)63Ofloxacin(氧氟沙星)5.288362.151 1362.158 51.06340.144 4,318.160 9,261.103 0,203.060 964Pefloxacin(培氟沙星)5.304334.156 1334.155 4-2.51314.129 1,288.160 9,265.114 3,231.055 865Norfloxacin(諾氟沙星)7.511320.140 5320.140 40302.128 8,288.150 0,231.055 9,205.076 666Ciprofloxacin(環(huán)丙沙星)5.321332.140 5332.140 4-0.36314.129 2,265.113 7,231.055 8,205.076 067Danofloxacin(達(dá)氟沙星)5.371358.156 1358.155 5-2.11342.160 2,316.181 6,255.055 5,203.060 768Lomefloxacin(洛美沙星)5.404352.146 7352.147 00.33340.144 7,318.161 1,261.102 7,245.107 969Enrofloxacin(恩諾沙星)5.470360.171 8360.170 1-4.84340.145 2,288.149 8,261.103 2,203.061 770Sarafloxacin(沙拉沙星)5.686386.131 1386.130 8-0.53368.120 5,342.139 7,299.097 3,285.082 571Cinoxacin(西諾沙星)6.233263.066 2263.066 2-0.3245.055 7,217.060 7,189.028 6,161.033 472Nalidixic acid(萘啶酸)7.386233.092 1233.091 7-0.33215.081 6,187.050 0,159.054 8,131.060 073Flumequine(氟甲喹)7.469262.087 4262.087 3-0.27244.075 9,234.134 3,202.029 1,174.034 274Nadifloxacin(那氟沙星)6.971361.155 8361.155 9-1.05320.140 2,262.088 1,233.092 5,187.050 375Tetracycline(四環(huán)素)5.495445.160 5445.159 8-1.61427.148 3,410.121 9,241.084 6,154.048 976Doxycycline(強(qiáng)力霉素)5.988445.160 5445.159 8-1.61428.133 8,321.074 1,267.063 9,201.054 877Chlortetracycline(金霉素)5.876479.121 6479.121 3-0.97462.093 5,444.083 7,275.046 4,154.049 978Oxytetracycline(土霉素)5.337461.155 5461.154 9-1.23443.143 6,426.117 3,201.053 9,154.049 679Lincomycin(林可霉素)5.064407.221 0407.219 4-4.32359.217 3,279.095 2,172.133 6,126.126 980Clindamycin(克林霉素)5.802425.187 1425.186 5-1.81422.263 5,350.222 2,174.111 6,101.059 5

1.2 儀器與設(shè)備

6530超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(美國Agilent公司)，包括G4220A流動相輸送泵、G4226A自動進(jìn)樣器、G1316C柱溫箱及G4212A二極管陣列檢測器；MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Agilent公司)；AE240電子天平(瑞士Mettler公司)；Allegra X-22R高速冷凍離心機(jī)(德國Beckman公司)；多管漩渦振蕩器(北京Targin公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品(根據(jù)純度折算質(zhì)量)，用色譜純甲醇溶解并定容至10 mL，制成1 g/L的單標(biāo)貯備液。對于每類化合物，將單標(biāo)貯備液混合制成50或100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)再根據(jù)需要混合或稀釋。配制好的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液置于4 ℃環(huán)境下低溫避光保存。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g牛乳樣品于50 mL離心管中，加入0.1 g Na2EDTA和20 mL 1%乙酸乙腈溶液，渦旋振蕩1 min，加入4.0 g無水硫酸鈉和1.0 g氯化鈉，渦旋振蕩4 min，8 000 r/min離心5 min。準(zhǔn)確移取10 mL上層清液于離心管中，加入1.0 g無水硫酸鈉和0.2 g C18，渦旋振蕩器振蕩 4 min，8 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液于40 ℃氮?dú)獯抵两?，?.0 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(5∶95，體積比)定容，渦旋30s，過0.22 μm濾膜后，供超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜測定。

1.5 儀器條件

1.5.1超高效液相色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相A為0.1% 甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～2 min，5% B，2～4 min，5%～40% B；4～9 min，40%～80% B；9～9.5 min，80%～95% B；9.5～15 min，95%B；15～17 min，95%～5%B；17～20 min，5%B；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件離子源：Dual AJS ESI，正離子模式；掃描范圍：50～1 000m/z；干燥氣溫度：320 ℃；干燥氣流速：8 L/min；霧化氣壓力：35 psig(1 psig=6 895 Pa)；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流速：12 L/min；毛細(xì)管電壓：4 000 V；噴嘴電壓：500 V；碎裂電壓：130 V；飛行時(shí)間管真空度：2.04×10-7Torr；儀器在高分辨率(4 GHz)，低質(zhì)量范圍(

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇比較了ZORBAX SB C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)、Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)和Extend C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)3種色譜柱對80種抗生素和激素藥物的分離度和檢測靈敏度。實(shí)驗(yàn)表明，ZORBAX SB C18色譜柱更適合于分析目標(biāo)藥物，雖然50 mm色譜柱用時(shí)更短，但不能保證每種藥物都有良好的峰形。在粒徑相同的情況下，采用100 mm色譜柱，結(jié)合高分辨質(zhì)譜的優(yōu)異性能，能獲得良好的分離度。80種抗生素和激素藥物的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 80種抗生素和激素藥物的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatogram of 80 antibiotics and hormones

2.1.2流動相的選擇以乙腈為有機(jī)系流動相，考察了不同pH值的水系流動相(水、0.1%甲酸水溶液、1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液、1%乙酸水溶液)對目標(biāo)藥物在色譜柱上分離效果的影響。結(jié)果表明，流動相酸度較高或不添加酸性溶液時(shí)，峰形較差。而在流動相中添加0.1%甲酸時(shí)，可提高目標(biāo)藥物的離子化效率，且分離效果令人滿意。故選擇乙腈和0.1%甲酸水溶液作為流動相，采用梯度洗脫方式可以很好地將80種抗生素和激素藥物分離，且具有較好的靈敏度和分辨率。

圖2 80種抗生素和激素藥物的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of 80 antibiotics and hormones

2.1.3梯度洗脫條件的優(yōu)化由于80種抗生素和激素的極性差異較大，采用恒定的流動相很難將各藥物分開，故采用梯度洗脫方式，通過改變流動相的極性，從而達(dá)到目標(biāo)藥物完全分離的目的。實(shí)驗(yàn)比較了初始流動相中不同比例的有機(jī)相(5%、10%、20%)和不同的洗脫時(shí)間(12、15、20 min)對洗脫效果的影響。結(jié)果顯示，隨著乙腈比例的升高，多數(shù)藥物被快速洗脫，未達(dá)到良好的分離，當(dāng)乙腈的初始比例為5%時(shí)，目標(biāo)藥物的洗脫速度緩慢，且分離良好。隨著洗脫時(shí)間的增加，全部藥物均能有較好的靈敏度和分辨率。故選擇初始流動相有機(jī)相比例為5%，洗脫時(shí)間為20 min。圖2為80種抗生素和激素藥物的總離子流色譜圖。

2.1.4定容液的選擇樣品定容液不僅會影響目標(biāo)藥物的分離效果，還會影響離子化效率。本實(shí)驗(yàn)比較了0.1% 甲酸水溶液，以及不同體積比(5∶95、20∶80、50∶50、90∶10)的乙腈-0.1%甲酸水溶液作為定容液時(shí)的分離情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)定容液有機(jī)相比例超過初始流動相中的有機(jī)相比例時(shí)，多數(shù)藥物的峰形變寬。當(dāng)有機(jī)相比例不大于初始流動相時(shí)，峰形較尖銳，本實(shí)驗(yàn)選擇體積比為5∶95的乙腈-0.1%甲酸水溶液作為定容液，此時(shí)有機(jī)相比例與初始流動相比例相同。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

Dual AJS ESI正離子模式下，在50～1 000m/z范圍內(nèi)作一級質(zhì)譜全掃描，得到80種抗生素和激素藥物的總離子色譜圖。比較各化合物的提取離子色譜圖的響應(yīng)強(qiáng)度和峰形，依次優(yōu)化鞘氣溫度和流速、噴嘴電壓、毛細(xì)管電壓、霧化氣壓力、干燥氣溫度和流速。然后優(yōu)化不同的碎裂電壓，在定性分析軟件中，選擇最優(yōu)電壓參數(shù)，詳細(xì)參數(shù)見“1.5.2”。

2.3 樣品前處理方法的選擇

2.3.1超濾膜方法的優(yōu)化稱取5.0 g牛乳樣品于50 mL離心管中，加入0.1 g Na2EDTA和20 mL 1%乙酸乙腈溶液，渦旋振蕩30 s，8 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液于40 ℃氮?dú)獯抵两桑?.0 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(5∶95)定容后，轉(zhuǎn)移至3 kD的超濾離心管中，15 000 r/min離心60 min，凈化后的提取液用于進(jìn)樣分析。實(shí)驗(yàn)比較了未經(jīng)初始流動相潤洗超濾膜(A組)和經(jīng)初始流動相潤洗超濾膜(B組)對超濾離心管凈化效果的影響。80種抗生素和激素的回收率數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)表明，A、B兩組的平均回收率均較低，分別為48.8%和54.8%，回收率整體不理想。這可能與超濾膜對藥物產(chǎn)生了吸附作用有關(guān)。

2.3.2QuEChERS提取步驟的優(yōu)化為了同時(shí)提取絕大多數(shù)的目標(biāo)藥物，實(shí)驗(yàn)比較了不同酸度的乙腈作為提取液：乙腈(A)、0.1%甲酸乙腈(B)、1%甲酸乙腈(C)、0.1%乙酸乙腈(D)、1%乙酸乙腈(E)。80種抗生素和激素的回收率數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，A、E兩組的平均回收率較高，分別為81.9%和83.1%。但A組的標(biāo)準(zhǔn)偏差為35%，E組為25%。E組的標(biāo)準(zhǔn)偏差更小，各化合物的回收率更接近，故選擇E組(1%乙酸乙腈)作為最佳提取溶劑。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用1%乙酸乙腈作為提取劑時(shí)，超過90%的藥物回收率為50%～120%，但3種四環(huán)素類藥物的回收率低于50%。推測四環(huán)素類藥物回收率低的原因可能與其易與牛奶中的鈣、鎂離子螯合形成難溶鹽有關(guān)[30]。為提高其回收率，在不影響其余目標(biāo)藥物的條件下，使用Na2EDTA作為螯合劑。結(jié)果顯示，5 g乳中加入0.1 g Na2EDTA，以20 mL 1%乙酸乙腈作為提取劑時(shí)，多西環(huán)素、土霉素、四環(huán)素及金霉素的回收率得到提高，分別為76%、65%、85%和101%。

2.3.3QuEChERS凈化步驟的優(yōu)化傳統(tǒng)的QuEChERS方法使用無水硫酸鎂作為吸水劑，但為了減少牛乳中的鎂離子，使Na2EDTA作為螯合劑能更好地發(fā)揮作用，實(shí)驗(yàn)選用無水硫酸鈉作為吸水劑。脂肪和蛋白質(zhì)干擾的消除對牛乳樣品的檢測至關(guān)重要。PSA和C18均可用于去除脂肪酸、色素和糖類等基質(zhì)成分。但文獻(xiàn)表明這些分散固相萃取劑在凈化樣品的同時(shí)有可能對目標(biāo)物產(chǎn)生一定的吸附作用，因此有必要對PSA(A組)和C18(B組)進(jìn)行優(yōu)化。80種抗生素和激素的回收率數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，B組的平均回收率較大，為90.0%，表明回收率趨勢更高。A組的四環(huán)素類藥物平均回收率低于50%，可能與PSA對其的吸附有關(guān)。此外，A組的標(biāo)準(zhǔn)偏差為38%，B組為19%，B組的標(biāo)準(zhǔn)偏差更小，各化合物的回收率更接近，故選擇B組(C18)作為最佳吸附劑。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超濾膜雖然能夠節(jié)省時(shí)間，簡化步驟，但方法的整體回收率偏低。QuEChERS方法更適用于藥物多殘留的分析。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)中的共提取干擾物影響目標(biāo)化合物的離子化，這也是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的弊端之一，因此有必要對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察。本實(shí)驗(yàn)在空白生鮮牛乳基質(zhì)提取液中添加不同濃度的80種抗生素和激素藥物混標(biāo)溶液，并與相應(yīng)初始流動相中的信號強(qiáng)度(即峰面積)進(jìn)行比較，以Matrix Effect (ME) 表示基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果如表2所示。從表中可以觀察到，61%的化合物基質(zhì)效應(yīng)不明顯，介于80%～120%之間。而睪酮、甲基睪酮、環(huán)丙沙星、四環(huán)素類藥物以及部分喹諾酮類藥物出現(xiàn)明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其余藥物均出現(xiàn)不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。取空白生鮮牛乳樣品基質(zhì)，根據(jù)目標(biāo)抗生素和激素在質(zhì)譜中響應(yīng)的強(qiáng)弱，加入不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“1.4”樣品前處理方法進(jìn)行提取，測定提取液中的目標(biāo)化合物。以待測物的分子離子峰面積對其質(zhì)量濃度(μg·L-1)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，各藥物在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2≥0.990 0)，80種抗生素和激素的線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2。

2.4.2檢出限與定量下限用空白牛乳基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度，以3倍儀器檢測信噪比(S/N=3)計(jì)算各化合物的定性篩查檢出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，80種抗生素和激素的LOD為2～50 μg/kg，LOQ為5～100 μg/kg。

2.4.3回收率與精密度在優(yōu)化條件下，采用空白生鮮牛乳樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差實(shí)驗(yàn)，樣品分別添加低(1LOQ)、中(2LOQ)、高(5LOQ)3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行測定6次，計(jì)算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。80種抗生素和激素藥物的回收率為 50.2% ～ 119%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3% ～19.0%。

表2 80種抗生素和激素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 2 Linear ranges，correlation coefficients(r2)，limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ)of 80 antibiotics and hormones

(續(xù)表2)

No.CompoundME/%Linear rangeρ/(μg·L-1)r2LODw/(μg·kg-1)LOQw/(μg·kg-1)58Sulfamethoxypyridazine75.610～2000.996 351059Sulfamethoxazole86.410～2000.999 251060Marbofloxacin12310～5000.990 051061Fleroxacin11810～5000.991 751062Enoxacin95.410～5000.995 351063Ofloxacin96.320～5000.991 6102064Pefloxacin84.210～5000.997 151065Norfloxacin85.350～5000.990 6205066Ciprofloxacin14210～5000.992 551067Danofloxacin12510～5000.999 951068Lomefloxacin86.210～2000.996 851069Enrofloxacin95.310～2000.999 451070Sarafloxacin87.420～2000.999 0102071Cinoxacin11210～5000.999 951072Nalidixic acid84.310～1000.999 451073Flumequine95.210～2000.995 751074Nadifloxacin11210～2000.996 751075Tetracycline13210～1 0000.996 351076Doxycycline12410～1 0000.998 451077Chlortetracycline12810～1 0000.999 951078Oxytetracycline12910～1 0000.995 851079Lincomycin87.55～5000.998 32580Clindamycin82.45～1 0000.994 425

2.5 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用本方法對全國8個(gè)省市的80份生鮮牛乳樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：頭孢氨芐檢出陽性1批，含量為19.1 μg·kg-1；替米考星檢出陽性2批，含量分別為6.8 μg·kg-1和6 μg·kg-1；泰樂菌素檢出陽性3批，含量分別為14.7 μg·kg-1、15.0 μg·kg-1和14.8 μg·kg-1；磺胺吡啶檢出陽性4批，含量分別為1.7 μg·kg-1、2.7 μg·kg-1、7.8 μg·kg-1和1.4 μg·kg-1；環(huán)丙沙星檢出陽性1批，含量為18.5 μg·kg-1，均低于農(nóng)業(yè)部規(guī)定的最高殘留限量。從檢測數(shù)據(jù)分析，孕酮的含量為20.8～32.5 μg·kg-1，平均值為26.1 μg·kg-1。由于孕酮為天然激素，推測可能為奶牛體內(nèi)的內(nèi)源性激素。

3 結(jié) 論

本文建立了生鮮牛乳中80種抗生素和激素藥物的超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜篩查與確證方法，改進(jìn)了前處理方法，優(yōu)化了色譜-質(zhì)譜條件。作為一種篩查方法，該方法適用于生鮮牛乳中80種抗生素和激素藥物的快速定性確證，可為監(jiān)管和監(jiān)督提供技術(shù)依據(jù)。