FTIR、ATR-FTIR和UV多光譜鑒別不同產(chǎn)地重樓

裴藝菲，左智天，趙艷麗，張慶芝，王元忠*

(1.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究所，云南 昆明 650200)

重樓為百合科植物云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand-Mazz.或七葉一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara的干燥根莖,苦，微寒，有小毒，歸肝經(jīng)，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效；外用于疔瘡癰腫、咽喉腫痛、蛇蟲咬傷、跌撲傷痛及驚風(fēng)抽搐[1]。植物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，重樓的主要化學(xué)成分為甾體皂苷類，此外，還含有多糖、黃酮、氨基酸等[2]。重樓具有抗腫瘤、抑菌、止血、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、肝臟保護、抑制血管生成等作用[3]，被廣泛應(yīng)用于中成藥，如云南白藥系列、宮血寧膠囊、清熱止咳顆粒、復(fù)方蛇膽川貝散、復(fù)方重樓酊等。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南省中藥材市場重樓藥材質(zhì)量參差不齊，價格差異較大。前人研究發(fā)現(xiàn)不同生長環(huán)境會形成膠質(zhì)和粉質(zhì)重樓，兩種質(zhì)地重樓活性成分與藥理作用存在較大差異，從而影響重樓藥材及其中成藥質(zhì)量，進而影響臨床療效[4]。目前，對于重樓化學(xué)成分的定性定量分析，主要采用高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)、超高效液相色譜(Ultra high performance liquid chromatography,UHPLC)、紅外光譜(Infrared spectra,IR)、紫外光譜(Ultraviolet,UV)、質(zhì)譜(Mass spectrometry,MS)等單一或多種技術(shù)聯(lián)用的方法[5-9]。Yang等[10]利用UHPLC-UV-MS和UV結(jié)合多元統(tǒng)計分析對3個不同地區(qū)的云南重樓進行區(qū)分，定量分析結(jié)果表明云南南部地區(qū)重樓中的總皂苷含量(19.9 mg·g-1)高于中部地區(qū)(8.79 mg·g-1)，進一步鑒別分析發(fā)現(xiàn)，UV比UHPLC更適于區(qū)別3個區(qū)域樣品,200～300 nm被認(rèn)為是區(qū)分不同區(qū)域云南重樓的重要波長范圍。

UV可快速準(zhǔn)確地測定化合物含量[11]。傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)因具有簡便無損的特點，已被應(yīng)用于食品及中藥材摻假鑒定、優(yōu)劣鑒定、產(chǎn)地溯源、化學(xué)成分分析等方面[12]。衰減全反射傅立葉變換紅外光譜(Attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy,ATR-FTIR)通過配備石英、鍺、硒化鋅等晶體材料ATR附件，簡化了樣品處理過程，提高了FTIR采樣成功率，作為一種快速無損的分析技術(shù)廣泛用于中草藥和食品化學(xué)成分研究領(lǐng)域[12-13]。Cebi等[14]將ATR-FTIR技術(shù)與化學(xué)計量學(xué)相結(jié)合檢測中藥減肥茶中的西布曲明，方法穩(wěn)定可靠。Nikzad-Langerodi等[15]利用ATR-FTIR技術(shù)結(jié)合生物活性數(shù)據(jù)建立了不同金銀花乙醇提取物抗炎特性的正交偏最小二乘判別模型，成功預(yù)測了提取物抑制炎癥反應(yīng)的能力。FTIR及ATR-FTIR一般采用400～4 000 cm-1波數(shù)范圍，UV采用190～380 nm波長范圍。由于不同技術(shù)提供互補信息可得到比單一技術(shù)更好的結(jié)果，使得數(shù)據(jù)融合策略逐步應(yīng)用于中藥基原鑒定等方面[16]。Yang等[17]將UV與FTIR(KBr壓片法測量)兩種光譜數(shù)據(jù)與化學(xué)計量學(xué)進行串聯(lián)融合，建立了偏最小二乘判別分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)與支持向量機(Support vector machine,SVM)判別模型，對采自云南的重樓樣品進行產(chǎn)地鑒別，經(jīng)篩選變量得到的中級融合分類效果較好；其正確率均達到80%以上，但并未獲得最佳鑒別效果。

為比較ATR-FTIR與FTIR的采集信息差異及模型分類效果，本研究擬使用ATR附件及KBr壓片技術(shù)分別測定重樓FTIR信息。采集云南省昆明市、怒江州、文山州、西雙版納傣族自治州及貴州省安順市、興義市6個產(chǎn)地重樓根莖的FTIR、ATR-FTIR、UV，建立單一光譜、低級數(shù)據(jù)融合(FTIR-UV及ATR-FTIR-UV)PLS-DA與SVM判別模型，旨在對FTIR與ATR-FTIR獲得的兩種重樓紅外光譜信息進行對比，分析使用FTIR與UV低級數(shù)據(jù)融合技術(shù)的分類效果，為準(zhǔn)確建立重樓產(chǎn)地鑒別模型及選擇優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料來源

在云南省怒江州、西雙版納傣族自治州、昆明市、文山州及貴州省興義市、安順市共采集156株重樓根莖，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院張慶芝教授鑒定為云南重樓P.polyphyllaSmith var.yunnanensis。將重樓樣品新鮮根莖洗凈陰干，切片置于50 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎，過100目篩，自封袋密封保存。

1.2 儀器與試劑

傅立葉變換紅外光譜儀配備ATR附件(ZnSe晶體材料)及DTGS檢測器(美國Perkin Elmer公司)；UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)；YP-2壓片機(上海山岳科學(xué)儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；CH936B除濕機(森井電氣公司)；DFY-50型中藥材粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；電子天平(梅特勒·托利多儀器有限公司)；超聲波清洗儀(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司)。

超純水系統(tǒng)；甲醇(分析純)；溴化鉀(分析純)。

1.3 FTIR、ATR-FTIR及UV采集參數(shù)條件

在保持室溫且干燥環(huán)境下，精確稱取1.0 mg重樓樣品與100 mg KBr粉末，于瑪瑙研缽內(nèi)混勻并研磨后壓成透明薄片，掃描(背景掃描采用100 mg KBr粉末壓成的透明薄片)。光譜采集范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描累積量16次，每個編號樣品重復(fù)3次，取FTIR平均光譜圖。

保持房間恒溫干燥，每次掃描前進行空氣的背景掃描，取重樓樣品粉末于干燥且潔凈的硒化鋅晶體材料上進行光譜掃描，累積掃描16次，壓力保持在130～140 Pa之間，光譜采集范圍650～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，單個樣品重復(fù)3次，取ATR-FTIR平均光譜圖。

精確稱取0.1 g重樓樣品于試管中，加入10 mL甲醇溶解，超聲40 min后過濾，收集濾液于干凈試管內(nèi)，紫外儀器預(yù)熱1 h后進行光譜采集，采用石英比色皿掃描空白甲醇，以減少基線漂移，采集重樓樣品UV圖譜，掃描間隔1 nm，單個樣品重復(fù)3次，取平均UV光譜圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理

重樓樣品的原始FTIR及ATR-FTIR光譜利用OMNIC軟件轉(zhuǎn)化吸光度；以UVProbe軟件對原始UV進行平滑等處理;SIMCA-P+13.0軟件對UV、FTIR、ATR-FTIR及經(jīng)ATR校正的ATR-FTIR(ATR-FTIR-A)光譜數(shù)據(jù)分別進行不同預(yù)處理，如一階導(dǎo)數(shù)(First derivatives,FD)、二階導(dǎo)數(shù)(Second derivatives,SD)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量(Standard normal variables,SNV)，以消除無關(guān)干擾(高頻隨機噪音、光散射、基線漂移、濃度不均等)，使模型準(zhǔn)確度增強，預(yù)測效果提升[18-20]。采用Kennard-Stone算法篩選2/3訓(xùn)練集與1/3預(yù)測集，通過SIMCA-P+13.0、MATLAB R2014a軟件分別建立PLS-DA及SVM判別模型。參考模型所得訓(xùn)練集分類正確率(AT)、預(yù)測集分類正確率(AP)、校正均方根誤差(Root mean square error of estimation,RMSEE)、交叉驗證均方差(Root mean square error of cross-validation,RMSECV)、預(yù)測均方根誤差(Root mean square error of prediction,RMSEP)等相關(guān)參數(shù)，選取最佳預(yù)處理方式(表1)。將不同單光譜信息直接串聯(lián)融合，建立低級數(shù)據(jù)融合的兩種判別模型，進而比較不同模型的穩(wěn)定性及對不同產(chǎn)地重樓的分類效果。

表1 不同光譜不同預(yù)處理方式下的模型結(jié)果對比Table 1 Comparison of models results with multiple spectra of different pretreatment combinations

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖1B為二階導(dǎo)數(shù)光譜圖，如圖所示，ATR-FTIR及ATR-FTIR-A在4 000～3 600 cm-1及2 500～1 700 cm-1范圍內(nèi)，C—H及C—O的伸縮振動等吸收較FTIR明顯。二階導(dǎo)數(shù)譜圖比原始譜圖顯示出更多細(xì)小信息，3 600～2 500 cm-1及1 700～650 cm-1范圍內(nèi)的一些特征峰峰形更明顯?？梢园l(fā)現(xiàn)，ATR-FTIR與FTIR信息基本吻合；ATR-FTIR對樣品無預(yù)處理操作，簡化了操作過程，在樣品檢測后還可進行回收，為重樓FTIR分析提供了比KBr壓片檢測法更高效簡單的技術(shù)。

圖2為不同產(chǎn)地重樓的FTIR、ATR-FTIR及ATR-FTIR-A譜圖。6個產(chǎn)地重樓樣品峰形及峰位類似，吸光度略有差異。KBr壓片法與ATR測得的FTIR數(shù)據(jù)顯示，各個產(chǎn)地重樓的吸光度強度有所不同，其中文山州樣品吸光度在使用傳統(tǒng)FTIR方法時比其他產(chǎn)地低，使用ATR-FTIR則為最高，可能原因是FTIR需研磨樣品至極細(xì)粉，而ATR-FTIR直接測定樣品獲得信息，導(dǎo)致吸光度大小產(chǎn)生差異。由于各產(chǎn)地間其他細(xì)微差異從圖中難以直接分辨，故需進一步利用紅外光譜數(shù)據(jù)建立判別模型進行分析。

2.2 紫外光譜分析

圖3A為所有重樓樣品的原始UV平均圖譜，其主要吸收峰在200～370 nm范圍內(nèi)，其中207 nm處可能是薯蕷皂苷或溶劑甲醇的吸收峰，222 nm可能對應(yīng)重樓皂苷Ⅶ的吸收，重樓皂苷C大致對應(yīng)283 nm處的吸收峰。Tatar等[24]利用UV測定纈沙坦含量時發(fā)現(xiàn)，與原始UV吸收和其它階導(dǎo)數(shù)光譜相比，二階導(dǎo)數(shù)譜具有較好的信噪比以及更清晰明確的峰值。圖3B為經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)處理的重樓紫外光譜圖，有效提高了譜圖分辨率，除原始光譜存在的特征吸收峰，還明顯存在213、238、249、275、288、303 nm等處的吸收峰。

圖2 不同產(chǎn)地重樓的紅外原始平均光譜圖Fig.2 Original Fourier transform infrared average spectra of P.polyphylla in different areasA.FTIR;B.ATR-FTIR;C.ATR-FTIR-A

2.3 偏最小二乘判別分析

PLS-DA是目前使用較多的基于偏最小二乘回歸的多元統(tǒng)計分類方法之一，該法是將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為一組線性潛在變量并用于分類變量預(yù)測，即包括x、y兩個變量，每一組x觀測值都對應(yīng)一個y變量，用于確定觀測數(shù)據(jù)所屬類別[25]。R2是認(rèn)定模型與數(shù)據(jù)匹配程度的一種度量標(biāo)準(zhǔn)，效果越好的模型的R2越接近于1。但僅憑這一項標(biāo)準(zhǔn)衡量模型效果略顯不足，因此還需要觀察Q2。Q2是代表交叉驗證所得百分比的一項擬合參數(shù)，Q2>0.5時表示模型具有良好的預(yù)測能力。RMSEE、RMSECV及RMSEP參數(shù)用來評價模型效果，其數(shù)值越小表示模型越穩(wěn)定，效果越好[26]。AT與AP分別表示訓(xùn)練集與預(yù)測集的分類正確率，數(shù)值越大正確率越高。

4種最佳預(yù)處理UV、FTIR、ATR-FTIR、ATR-FTIR-A單光譜及不同紅外光譜與UV低級數(shù)據(jù)融合的PLS-DA模型參數(shù)如表2所示。就單一光譜而言，經(jīng)過ATR校正處理的ATR-FTIR模型效果最佳，AT與AP也都達到100.00%。紅外光譜與UV低級數(shù)據(jù)融合模型鑒別精度較相應(yīng)單一紅外光譜均有所提高。就ATR-FTIR-A-UV模型而言，其預(yù)測正確率與ATR-FTIR-A同為100%，但ATR-FTIR-A-UV的R2、Q2值更接近于1，RMSEE、RMSECV、RMSEP值也均有所減小，故ATR-FTIR-A與UV的低級數(shù)據(jù)融合模型更可靠。通過比較模型參數(shù)值發(fā)現(xiàn)，ATR-FTIR-A的PLS-DA模型各參數(shù)均好于FTIR-UV模型，即前者分類效果更好。

表2 不同光譜PLS-DA模型參數(shù)值Table 2 The model parameters of PLS-DA models with different spectra

2.4 支持向量機判別分析

支持向量機(SVM)是一種有監(jiān)督的分類化學(xué)計量工具，通過最大化分類超平面和訓(xùn)練集最接近樣本的距離，搜索不同數(shù)據(jù)類別之間最優(yōu)分離超平面[27]。SVM包含兩個參數(shù)，c作為一個懲罰參數(shù)，可控制SVM泛化能力，減小過擬合現(xiàn)象；而核函數(shù)參數(shù)g與模型的穩(wěn)定程度有關(guān)。SVM模型不受異常值的影響，對控制樣本數(shù)量要求不嚴(yán)格[25]。

表3為不同單一光譜與低級數(shù)據(jù)融合建立SVM模型所得特征參數(shù)值，Bestc、Bestg分別代表模型最佳懲罰參數(shù)與核函數(shù)參數(shù)。UV模型的AT與AP分別為62.50%和73.08%，相差10.00%以上，F(xiàn)TIR、ATR-FTIR及ATR-FTIR-A單光譜的AT與AP相差均在5.00%以內(nèi)，表明利用UV數(shù)據(jù)建立的SVM模型可靠性較差，ATR-FTIR-A在單光譜SVM模型中鑒別精度最高，效果最佳。不同紅外光譜與UV相融合建立的SVM模型的正確率均高于相應(yīng)單一紅外光譜SVM模型，c、g值也處于正常范圍內(nèi)，模型穩(wěn)定，說明數(shù)據(jù)融合效果優(yōu)于單光譜。FTIR-UV模型AT與AP均為90.38%，ATR-FTIR-A分別為97.12%和100.00%，ATR-FTIR-A-UV融合模型正確率更高，達到99.04%及100.00%，故ATR-FTIR-A的SVM分類模型可用于有效區(qū)分不同來源重樓，ATR-FTIR-A-UV鑒別精度更高，體現(xiàn)了數(shù)據(jù)融合的準(zhǔn)確性與有效性。

表3 不同光譜SVM模型參數(shù)值Table 3 The model parameters of SVM models with different spectra

圖4A、C分別為利用FTIR-UV、ATR-FTIR-A-UV低級融合數(shù)據(jù)建立SVM分類模型時篩選Bestc及Bestg所得的最優(yōu)分離超平面圖，圖4B、D分別為FTIR-UV及ATR-FTIR-A-UV的SVM模型預(yù)測集實際與預(yù)測分類結(jié)果圖。圖4A所得超平面平滑程度較圖4C差，正確率也相應(yīng)偏低。圖4B中有5個預(yù)測集樣本分類錯誤：第2類中有1個樣本錯分到第4類，第4類中有1個樣本錯分在第2類，以及有3個樣本錯分到第6類，而圖4D全部分類正確，表明ATR-FTIR-A-UV的SVM分類模型效果明顯好于FTIR-UV。

3 結(jié) 論

ATR-FTIR技術(shù)省略了樣品預(yù)處理過程，無損操作，樣品檢測后可回收，為重樓提供了簡便準(zhǔn)確的紅外分析技術(shù)。該技術(shù)簡化了重樓分類模型的建立過程，極大提升了鑒別效果。直接利用ATR-FTIR-A單一光譜建立的PLS-DA或SVM產(chǎn)地鑒別模型分類正確率高，在實際生產(chǎn)中高效簡便；若進一步采用ATR-FTIR-A-UV低級數(shù)據(jù)融合建立模型可加強模型的穩(wěn)定性。

圖4 最優(yōu)分離超平面圖(左)和SVM分類結(jié)果圖(右)Fig.4 Optimal separation of hyperplane(left) and classification result of SVM(right)A,B:FTIR-UV，C,D:ATR-FTIR-A-UV