基于UPLC-Q-Orbitrap MS法分析補(bǔ)肺益腎方的化學(xué)成分

黃海英,康俊麗,余亞輝,趙 鵬,馮素香,杜 燕,李建生，3*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046;2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；3.河南中醫(yī)藥大學(xué) 河南省中醫(yī)藥防治呼吸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046)

補(bǔ)肺益腎方源于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的應(yīng)用臨床驗(yàn)方，由人參、黃芪、山茱萸、醋五味子、淫羊藿(炙)、浙貝母和陳皮等12味藥組成，為臨床有效方劑，具有補(bǔ)肺益腎、益氣化痰、止咳平喘等功效。本課題組前期采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合藥學(xué)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，該復(fù)方可有效緩解慢性阻塞性肺炎(COPD)患者的肺功能下降，減少急性加重發(fā)作的次數(shù)和程度，改善肺功能[1-2]，其機(jī)制可能是調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription,STAT)STAT3和STAT5通路中輔助性T 細(xì)胞17(Th17)/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)平衡[3]。采用高效液相色譜(HPLC)法與細(xì)胞藥效學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，該復(fù)方的主要有效成分為皂苷類、單萜類和黃酮醇類成分[4]，但由于其組成藥物較多，全面了解該復(fù)方的化學(xué)成分，對于后續(xù)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)具有積極作用。

高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜(如Orbitrap技術(shù))與線性離子阱的結(jié)合，可提供豐富的具有高分辨率和快速掃描速度的MSn信息(全掃描時(shí)每次掃描≤1 ms)，并提供高質(zhì)量精度(誤差小于5×10-6)，因此廣泛用于各種化合物的結(jié)構(gòu)解析。超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Orbitrap MS)結(jié)合了UPLC的高效分離能力和MS的強(qiáng)大結(jié)構(gòu)表征能力，從而提供了快速、靈敏、可靠和高通量的平臺，可廣泛獲得化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)的碎片離子，已用于中藥復(fù)方的成分鑒定[5-6]。本研究采用UPLC-Q-Orbitrap MS方法結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)庫對補(bǔ)肺益腎方進(jìn)行化學(xué)成分分析，以闡明其藥物化學(xué)成分，為該復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制等研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Q-Exactive臺式四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、Xcalibur質(zhì)譜工作站、Mass Frontier 6.0 軟件、UltiMate3000高效液相色譜儀(Thermo Scientific公司)；Phenomenex kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；Milli-Q處理純凈水(美國Millipore公司)；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo)。

超純水(自制)；乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司)；實(shí)驗(yàn)所用藥物由國家中醫(yī)臨床研究基地河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床藥理研究基地提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1供試品溶液的制備取1.2 g補(bǔ)肺益腎顆粒于潔凈干燥的具塞錐形瓶中，加入50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇20 mL，稱重。超聲處理60 min，取出冷卻至室溫，以50%甲醇補(bǔ)足減失重，搖勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm濾膜后，即得。

1.2.2色譜條件色譜系統(tǒng):UPLC-Q-Orbitrap MS(Thermo Scientific公司)；色譜柱：Phenomenex kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；流速：0.2 mL/min；柱溫：25 ℃；流動相：A為1‰甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～2 min，5%B；2～5 min，5%～20%B；5～20 min，20%～25%B；20～23 min，25%～50%B；23～40 min，50%～100% B;進(jìn)樣量：5 μL。

1.2.3質(zhì)譜條件電噴霧離子化源(ESI)，采用正、負(fù)離子模式分別進(jìn)行檢測；載氣為氮?dú)猓蕷鈮毫?.5 MPa，輔助氣流速3.3 L/min，噴霧電壓3.50 kV，透鏡電壓 120 V。毛細(xì)管溫度350 ℃，輔助氣加熱溫度200 ℃，分辨率為70 000，掃描方式為全掃描，掃描范圍:m/z100～1 500。

2 結(jié)果與討論

2.1 補(bǔ)肺益腎方的化學(xué)成分

按照“1.2”實(shí)驗(yàn)條件對補(bǔ)肺益腎方進(jìn)行質(zhì)譜分析，分別得到正離子和負(fù)離子模式下的總離子流圖(圖1)。根據(jù)文獻(xiàn)[7-35]檢索建立補(bǔ)肺益腎方的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，應(yīng)用儀器自帶Xcalibur 3.2軟件計(jì)算化合物的化學(xué)組成(誤差小于5×10-6)，通過特征碎片離子峰、歸屬信息，應(yīng)用Mass Frontier 6.0 工作站輔助推測功能并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道推斷化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過質(zhì)譜解析軟件共鑒定出242個(gè)化學(xué)成分，其中負(fù)離子模式下鑒定37個(gè)成分，人參23個(gè)，黃芪14個(gè)(表1)；正離子模式下鑒定205個(gè)化學(xué)成分：其中人參10個(gè)，黃芪17個(gè)，赤芍28個(gè)，浙貝母9個(gè)，炒紫蘇子63個(gè)，陳皮9個(gè)，矮地茶8個(gè)，酒萸肉7個(gè)，醋五味子26個(gè)，淫羊藿(炙)28個(gè)(表2)。

No.Retention time(min)FormulaNameTheoretical(M-H)Measured(M-H) Error(ppm) Fragment (m/z) SourceReference110.76C21H18O13槲皮素-3-O-glu477.067 5477.068 54.471477AR[7]212.01C48H82O19人參皂苷20-Glc-Rg1961.537 8961.535 3-1.4111 007,961GRR[8]314.40C42H72O14人參皂苷Rg1799.484 9799.484 00.209845,799GRR[8]414.44C44H70O15綿毛黃芪苷Ⅱ837.464 2837.461 5-1.908837AR[7]514.74C48H82O18人參皂苷Rd945.542 8945.542 30.590991,945GRR[8]618.81C15H10O6山奈酚285.040 5285.040 91.536331,285AR[7]720.38C51H84O21人參皂苷Malonyl-Rd1 031.543 21 031.542 60.4501 031GRR[8]824.03C44H70O15綿毛黃芪苷Ⅲ837.464 2837.461 0-2.505883,837AR[7]924.15C42H72O14人參皂苷Rf799.484 9799.484 50.834845,799GRR[8]1024.27C41H68O14黃芪甲苷783.453 6783.453 71.490829,783AR[7]1124.37C59H100O27人參皂苷Ra31 239.637 91 239.636 8-0.0191 285,1 239GRR[8]1224.45C54H92O23人參皂苷Rb11 107.595 71 107.591 7-0.0591 107,945,783,621,459GRR[8]1324.45C41H70O13三七皂苷R2769.474 4769.474 71.860769,815GRR[8]1424.48C42H72O13人參皂苷Rg2783.490 0783.486 5-3.087829,783GRR[8]1524.49C58H98O26人參皂苷Ra1,Ra21 209.627 41 209.626 50.1991 255,1 209GRR[8]1624.69C53H90O22人參皂苷Rc1 077.581 41 077.585 1-2.4131 123,1 077,945,915,783GRR[8]1724.74C57H94O26人參皂苷Malonyl-Rb11 193.595 31 193.596 10.2861 193GRR[8]1824.75C53H90O22人參皂苷Rb21 077.583 21 077.585 11.8001 123,1 077,945,915,783GRR[8]1924.80C53H90O22人參皂苷Rb31 077.582 01 077.585 11.7001 123,1 077,945,915,783GRR[8]2024.82C43H72O14人參皂苷Rg5811.184 9811.485 82.424811GRR[8]2124.85C49H80O19綿毛黃芪苷Ⅻ971.522 1971.521 90.920971AR[7]2224.86C55H92O23人參皂苷Rs1,Rs21 119.595 71 119.595 00.3881 165,1 119GRR[8]2324.86C56H92O25人參皂苷Malonyl-Rb2,malonyl-Rb3,malonyl-Rc1 163.585 51 163.585 10.6061 163GRR[8]2424.94C48H76O19人參皂苷Ro955.490 8955.489 90.203955GRR[8]2524.97C41H68O14異黃芪甲苷783.453 6783.453 91.745829,783AR[9]2625.06C48H82O18人參皂苷Re945.542 8945.542 81.119991,945GRR[10]2725.27C51H84O21人參皂苷Malonyl-Re1 031.543 21 031.543 51.3231 031GRR[10]2825.48C48H82O19人參皂苷20-Glc-Rf961.537 8961.536 6-0.059961GRR[10]2925.60C47H76O17黃芪皂苷Ⅷ911.501 0911.502 22.548957,911AR[7]3025.64C48H78O18大豆皂苷Ⅰ941.511 5941.514 03.779987,941AR[9]3125.64C48H78O18綿毛黃芪苷Ⅸ941.511 5941.512 92.611987,941AR[9]3226.02C43H72O14人參皂苷Rg6811.184 9811.486 22.917811GRR[10]3326.02C42H68O14綿毛黃芪苷Ⅴ/Ⅵ795.453 6795.454 92.976795AR[9]3426.76C42H72O13人參皂苷Rg3783.490 0783.488 5-0.534829,783GRR[10]3528.83C41H66O15黃芪皂苷Ⅱ797.432 9797.433 82.511797AR[9]3630.37C41H68O14黃芪皂苷Ⅲ783.453 6783.453 41.107829,783AR[9]3737.77C18H32O2亞油酸279.233 0279.233 14.452279AR[9]

*AR：Astragali Radix(黃芪)；GRR：Ginseng Radix Rhizoma(人參)

表2 正離子模式下的補(bǔ)肺益腎方化學(xué)組分Table 2 Identification of compounds in Bufei Yishen formula by UPLC-Q-Orbitrap MS in positive ion mode

(續(xù)表2)

No.Retention time(min)FormulaNameTheoretical(M+H)Measured(M+H)Error(ppm)Fragment(m/z)SourceReference509.00C22H22O10毛蕊異黃酮苷447.128 6447.128 4-0.388285AR[9]519.07C11H16O3芍藥苷降解物197.117 2197.117 2-0.106197,179,161,137,135,123,109PR[29]529.14C16H24O10脫苯甲酰芍藥苷377.145 6377.145 22.59377,243,200,172PR[18]539.15C21H20O10阿福豆苷433.112 9433.112 9-0.054287EH[34]549.22C9H10O34-羥基苯甲酸乙酯167.070 3167.070 2-0.071167,149,125PR[16]559.30C27H43NO3浙貝酮430.331 6430.331 3-0.629430,412FTB[32]569.39C23H28O114-表-芍藥內(nèi)脂苷481.157 2481.157 40.051453,197,179,161,135PR[19]579.42C10H14對聚傘花素135.116 8135.116 7-0.94135,93PF[29]589.48C21H20O11三葉豆苷449.107 8449.107 1-0.438287EH[34]599.53C27H43NO3貝母素乙430.331 6430.331 5-0.164430,412FTB[32]609.60C21H20O12金絲桃苷465.102 8465.102 80.102303,153,127,109EH[34]619.68C7H6O5沒食子酸171.028 8171.028 80.001171,153,135,127,125,109,107,81PR[15]629.70C17H14O7苜蓿素331.081 2331.081 1-0.39331EH[34]639.79C10H16O紫蘇醇153.127 4153.127 3-0.092153,135,107PF[30]649.85C10H16O香葉醛153.127 4153.127 3-0.09297,135,153PF[29]6510.06C11H14O2甲基丁香酚179.106 7179.106 70.244179,151,137,117PF[30]6610.27C17H14O6熊竹素315.086 3315.085 3-3.22315AR[7]6710.32C12H14O5三甲氧基肉桂酸239.091 4239.091 2-0.837239,193PF[29]6810.42C16H12O7異鼠李素317.065 6317.065 60.066317AR[7]6910.43C27H32O14柚皮苷581.556 0581.535 00.012581,419CRP[12]7010.44C21H22O9柚皮素419.133 7419.133 70.099419CRP[12]7110.51C10H10O2四環(huán)-7-辛烯-4-羧酸甲酯163.075 4163.075 3-0.344163,131,103GRR[8]7210.68C19H32O7布盧門醇C葡糖苷373.222 1373.222 10.054135,109EH[34]7310.77C13H20O24-羥基-α-紫羅蘭酮193.158 7193.158 70.042193,147,137,133,95,79PF[29]7410.78C30H32O15沒食子酰芍藥苷633.181 4633.180 6-0.791285,153,105PR[15]7510.80C15H14O6兒茶素291.086 3291.086 3-0.05291,245,165,153,149,127,121,109PR[15]7610.84C15H20α-去二氫菖蒲烯201.163 8201.163 5-1.378201,145,131,105,91AJH[23]7711.03C21H20O11木犀草素-7-氧-glu苷449.107 8449.107 6-0.53303,287,129,85PF[11]7811.06C21H20O11槲皮苷449.107 8449.107 1-1.643287EH[34]7911.06C15H10O7槲皮素303.049 9303.049 9-0.096303,165,153,137EH/PF/AR[34]8011.16C32H38O164-烴基-8-異戊烯基黃酮-7-O-葡萄糖679.223 3679.223 0-0.385355,85EH[34]8111.21C22H24O11橙皮素-7-O-葡萄糖465.139 1465.138 9-0.238303,179,163,153,123CRP[13]8211.40C28H32O14刺槐黃素-7-O-蕓香苷593.186 5593.186 1-0.644269PF[11]8311.46C27H45NO2鄂貝啶堿416.352 3416.352 3-0.015416FTB[32]8411.98C12H16O3細(xì)辛腦209.117 2209.117 1-0.578209,181,173,139PF[30]8512.22C18H16O8迷迭香酸361.091 8361.091 4-1.091361,197,191,167,163,153,137,135PF[11]8612.25C27H45NO3異貝母素甲432.347 2432.347 0-0.511432,414FTB[32]8712.26C28H34O15橙皮苷611.197 0611.196 7-0.567369,303,153,129CRP[13]8813.25C15H16O4Calodendrolide261.112 1261.112 1-0.136261,243,177,159,105CF[27]8913.25C27H45NO2蒲貝素A及同分異構(gòu)體416.352 3416.352 2-0.255416FTB[32]9013.37C22H22O9芒柄花苷431.133 7431.133 1-1.296269AR[22]9113.38C22H22O8苦鬼臼毒素415.138 7415.138 6-0.347415,373,295,181,135FTB[31]9213.56C27H43NO2浙貝丙素414.336 7414.336 1-1.342414FTB[32]9313.59C16H12O4芒柄花素269.080 8268.080 1-2.733269,107AR[7]9414.41C12H16O3異欖香素209.117 2209.116 7-2.491209,181,173,139PF[30]9514.52C36H60O8人參皂苷Rh4621.436 1621.435 1-1.602109,95,69GRR[10]9614.59C15H22芳-姜黃烯203.179 4203.179 50.358203,161,147,133,121,119,93,91AJH[23]9714.65C12H16O7熊果苷273.096 9273.096 5-1.389111PR[18]

(續(xù)表2)

No.Retention time(min)FormulaNameTheoretical(M+H)Measured(M+H)Error(ppm)Fragment(m/z)SourceReference9814.70C15H181,4-二甲基-7-(1-甲基乙基 )-奧苷菊環(huán)199.148 1199.147 8-1.643199,157,91,81AJH[23]9914.87C10H16檸檬烯137.132 5137.132 4-0.562137,109,95,81,67PF[30]10014.88C8H8O43,4-二羥基苯甲酸甲酯169.049 5169.049 4-0.135169,151PF[29]10114.90C18H13N3O27β-羥基吳茱萸次堿304.108 1304.108 82.456304,221,158,143,136,130,117,103CF[27]10214.94C10H16右旋-α-蒎烯137.132 5137.132 50.167137,109,95,81SCF[19]10315.04C30H32O13苯甲酰氧化芍藥苷601.191 6601.191 0-0.567121,105PR[15]10415.23C14H18O21,4-雙(1-羥基環(huán)戊基)-1,3-丁二炔219.138 0219.138 00.199219,67GRR[8]10515.50C21H18O11芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷447.092 2477.092 1-0.196271PF[11]10615.74C10H16樟腦萜137.132 5137.132 50.167137,109,95SCF[19]10716.12C30H32O12Paeonivayin585.198 6585.193 83.47541,463,197PR[15]10816.43C30H26O14木犀草素-7-咖啡酰葡萄糖苷611.139 5611.139 5-0.032153,85PF[11]10917.06C26H30O11淫羊藿屬苷C519.176 1519.186 10.023373EH[34]11017.19C22H24O7戈米辛 R401.159 5401.159 3-0.448383,341SCF[20]11117.45C16H24O8牡丹皮苷F345.154 4345.154 2-0.194345,299,285,181,165,153,125PR[15]11217.59C23H28O10黃芪異黃烷苷465.175 5465.175 0-1.125123,97AR[7]11317.60C17H18O5(3R) 8,2'-二羥基-7,4'-二甲氧基異黃烷303.122 7303.122 7-0.001193,149,123AR[25]11418.17C16H12O5毛蕊異黃酮285.075 8285.075 5-0.877285,253AR[9]11518.18C17H16O58-羥基-6,7-二甲氧基黃烷酮301.107 1301.106 9-0.499301,197,103PF[29]11618.48C15H24O斯巴醇221.190 0221.190 00.036221,203,163,147,135,121,109,107,105PF[20]11718.79C15H10O6木犀草素287.055 0287.055 0-0.051287,153PF[29]11819.45C12H16O3欖香素209.117 2209.117 2-0.1209,181,173,139PF[30]11921.33C38H48O19朝藿定B809.286 3809.285 7-0.686369,97EH[35]12022.47C27H30O11淫羊藿次苷Ⅰ531.186 1531.185 9-0.354369,313EH[34]12122.52C39H50O19朝藿定C823.301 9823.301 9-0.007369,129,111EH[35]12222.65C5H7NO3焦谷氨酸130.049 9130.050 11.771130,84PF[11]12322.94C33H40O15淫羊藿苷677.244 0677.244 00.005369,313,85,71EH[34]12423.27C33H40O15箭藿苷A(寶藿苷Ⅶ)677.244 0677.244 00.005369,313,85EH[34]12523.40C15H10O5芹菜素271.060 1271.059 9-0.738271,153,119PF/EH[29]12623.78C15H10O5大黃素271.060 1271.059 9-0.718271AR[25]12723.84C30H32O12苯甲酰芍藥苷585.196 7585.196 80.252249,197,179,127,123,105,97,77PR[15]12823.91C27H32O11淫羊藿素-3-鼠李糖苷533.201 7533.201 7-0.072387,369,85EH[34]12923.95C30H32O12苯甲酰芍藥內(nèi)酯苷585.196 7585.196 70.081197,121,105,85PR[15]13024.10C18H34O5松油酸331.247 9331.247 3-1.813245,165,109,97,95PF[11]13124.14C16H12O6金圣草黃素301.070 7301.070 2-1.543301,269,153PF[29]13224.24C37H36O193',6'-二-O-沒食子?；炙庈?85.467 6785.468 2-0.742481,197,105PR[16]13324.26C10H14O紫蘇烯151.111 7151.111 7-0.276151,123,109,95,93,81PF[30]13424.36C36H60O7人參皂苷Rh3605.441 2605.440 6-0.959123,109,107,95,85,81GRR[10]13524.57C16H12O6鼠李檸檬素301.070 0301.070 0-2.207301,269AR[7]13624.64C23H28O13S芍藥苷亞硫酸酯545.132 3545.133 52.132441,243,175PR[15]13724.69C18H32O313-羥基-9,11-十八碳二烯酸297.242 4297.241 9-1.754279,261,125,123,109AR[7]13824.71C35H42O16箭藿苷C719.254 6719.252 9-2.31369,313,85EH[35]13924.73C20H20O8桔皮素389.123 1389.122 5-1.527389,359CRP[12]14024.74C15H24O環(huán)氧石竹烯221.190 0221.189 7-0.292221,203,175,161,147,133,121,109,107PF[30]

(續(xù)表2)

(續(xù)表2)

No.Retention time(min)FormulaNameTheoretical(M+H)Measured(M+H)Error(ppm)Fragment(m/z)SourceReference18529.13C30H34O8苯甲酰戈米辛H523.232 6523.232 2-0.849105SCF[20]18629.51C15H26O法呢醇223.205 6223.205 6-0.042111,95,81PF[29]18729.79C10H12O2丁香酚165.091 0165.091 1-0.037165,147,137,123PF[30]18829.89C15H22O恰米醛219.174 3219.174 3-0.191219,163,135,123,109SCF[20]18930.19C23H26O7新異五加內(nèi)脂素415.175 1415.175 1-0.071415SCF[20]19030.21C15H26O藍(lán)桉醇223.205 6223.205 6-0.042147,121,111,109,107PF[29]19130.60C22H22O7寶藿素399.143 8399.143 8-0.074399,357EH[34]19230.81C23H30O6戈米辛 K1403.211 5403.211 5-0.038403,371SCF[20]19330.91C15H22菖蒲烯203.179 4203.179 50.358203,175,161,147,133,119,91AJH[23]19431.12C15H24白菖烯205.195 1205.195 10.11205,149,135,121,109,107,105SCF[19]19531.22C22H24O6五味子丙素385.164 6385.164 60.091385,355SCF[27]19631.44C23H28O6五味子乙素(γ-五味子醇甲)401.195 9401.194 50.087401,369,165SCF[20]19731.53C30H32O9五味子酯甲537.211 9537.210 9-1.878367,105SCF[27]19831.63C15H22去氫白菖烯203.179 4203.179 50.358203,175,161,147,133,119,91PF[29]19932.47C17H24O人參炔醇/人參新萜醇245.190 0245.189 9-0.375245GRR[8]20032.52C15H241-石竹烯205.195 1205.195 10.11205,149,135,123,121,109,107AJH/SCF[19]20132.52C15H28O2肉豆蔻腦酸甲酯241.216 2241.216 1-0.44297GRR[8]20233.12C15H24反-α-金合歡烯205.195 1205.195 10.11205,149,135,121,109PF[30]20333.28C15H22O4,6,6-三甲基-2-(3-甲基-1,3-丁二烯基)-3-氧雜三環(huán)[5.1.0.0(2,4)]辛烷219.174 3219.174 40.265219,163,159,145,137,135,123GRR[8]20433.80C15H24O氧化石竹烯221.190 0221.189 9-0.416221,163,161,147,135,121,119,109AJH[23]20535.12C19H27NO1-甲基-2-正壬基-4(1H)-喹諾酮286.216 5286.216 5-0.143286,118SCF[27]

*PR：Paeoniae Rubra Radix(赤芍)；SCF ：Schisandrae Chinensis Fructus(醋五味子)；GRR：Ginseng Radix Rhizoma(人參)；CF：Corni Fructus(酒萸肉)；CRP：Citri Reticulatae Pericarpium(陳皮)；PF：Perillae Fructus(炒紫蘇子)；EH：Epimedii Herba(淫羊藿(炙))；AJH：Ardisiae Japonicae Herba(矮地茶)；AR：Astragali Radix(黃芪)；FTB：Fritillariae Thunbergii Bulbus(浙貝母)

2.2 補(bǔ)肺益腎方主要化學(xué)成分的裂解規(guī)律

2.2.1皂苷類成分的裂解規(guī)律前期研究發(fā)現(xiàn)皂苷類成分在該復(fù)方中數(shù)量較多，但由于皂苷類成分在正離子模式下的MS響應(yīng)較差，故采用負(fù)離子模式進(jìn)行鑒別。在裂解過程中，分子離子峰多為丟失glu分子，這與報(bào)道一致[10]。以人參中的人參皂苷Rb1為例，UPLC-Q-Orbitrap MS測定的保留時(shí)間為24.45 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z1 107.591 7[M-H]-，產(chǎn)生的特征二級離子碎片有m/z945.542 9、783.487 2、621.434 2、459.382 2；其中m/z1 107為 [M-H]-，m/z945為[M-glu-H]-，m/z783為[M-2glu-H]-，m/z621為[M-3glu-H]-，m/z459為[M-4glu-H]-，為人參皂苷Rb1的特征碎片；結(jié)合數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)報(bào)道，該碎片與人參皂苷Rb1的理論裂解碎片相似度高，推測該結(jié)構(gòu)為人參皂苷Rb1。人參皂苷Rb1的總離子流圖、二級質(zhì)譜解析及裂解途徑見圖2。

2.2.2芍藥苷類成分的裂解規(guī)律芍藥中多含單萜糖苷類化合物，通過對比數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，裂解過程中易丟失1分子葡萄糖[M-162]+，同時(shí)母核上易丟失苯甲酸分子，留有1分子母核m/z197碎片，并同時(shí)形成m/z121碎片，該碎片進(jìn)一步丟失1分子羥基，形成m/z105碎片[16]。以芍藥苷為例，UPLC-Q-Orbitrap MS測定的保留時(shí)間為7.91 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z481.169 9[M+H]+；其產(chǎn)生的特征二級離子碎片有m/z197.080 3、137.059 7、121.064 5、105.033 9；其中m/z197為[M+H-C7H5O-H2O-C6H11O6]+，m/z137為[M+H-C15H21O9]+，m/z105為[M+H-C16H23O9-H2O]+，為芍藥苷的特征碎片；結(jié)合數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)報(bào)道，該碎片與芍藥苷的理論裂解碎片相似度高，推測該結(jié)構(gòu)為芍藥苷。芍藥苷的總離子流圖、二級質(zhì)譜解析及裂解途徑見圖3。

圖2 人參皂苷Rb1的總離子流圖(A)、二級質(zhì)譜裂解圖(B)與裂解規(guī)律(C)Fig.2 TIC(A)，secondary mass spectrum(B) and proposed fragmentation pathways(C) of ginsenoside Rb1

圖3 芍藥苷的總離子流圖(A)、二級質(zhì)譜裂解圖(B)與裂解規(guī)律(C)Fig.3 TIC(A)，secondary mass spectrum(B)and proposed fragmentation pathways(C) of paeoniflorin

2.2.3生物堿類成分的裂解規(guī)律以浙貝母中貝母素甲為例，UPLC-Q-Orbitrap MS測定的保留時(shí)間為8.76 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z432.346 7 [M+H]+，該分子易丟失小分子H2O，產(chǎn)生特征二級離子碎片[M+H-H2O]+，m/z414.335[32]；結(jié)合數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)報(bào)道，該碎片與貝母素甲的理論裂解碎片相似度高，推測該結(jié)構(gòu)為貝母素甲。貝母素甲的總離子流圖、二級質(zhì)譜解析及裂解規(guī)律見圖4。

圖4 貝母素甲的總離子流圖(A)、二級質(zhì)譜裂解圖(B)與裂解規(guī)律(C)Fig.4 TIC(A)，secondary mass spectrum(B)and proposed fragmentation pathways(C) of peimine

2.2.4黃酮醇類成分的裂解規(guī)律與數(shù)據(jù)庫對比發(fā)現(xiàn)，該復(fù)方中的黃酮醇類成分檢出較多。以黃酮苷為代表，其母核為黃酮醇類，8位上有異戊二烯基，MS數(shù)據(jù)顯示，該分子易脫去2分子糖鏈形成m/z369碎片，為其基本母核，在此基礎(chǔ)上脫去1分子異戊二烯基，形成m/z313碎片[35]。以淫羊藿苷為例，UPLC-Q-Orbitrap MS測定的保留時(shí)間為22.94 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z677.244 0[M+H]+，其產(chǎn)生的特征二級離子碎片有m/z369.133 9、313.070 9、129.054 6；其中m/z369為[M+H-C6H10O5-C6H10O4]+，m/z313為[M+H-C6H10O5-C6H10O4-C4H8]+，為淫羊藿苷的特征碎片；結(jié)合數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)報(bào)道，該碎片與淫羊藿苷的理論裂解碎片相似度高，推測該結(jié)構(gòu)為淫羊藿苷。淫羊藿苷的總離子流圖、二級質(zhì)譜解析及裂解規(guī)律見圖5。

2.2.5木質(zhì)素類成分的裂解規(guī)律木質(zhì)素由2分子苯丙素衍生物聚合而成，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在能量攻擊下易丟失小分子(如CO、H2O等)[20]。以醋五味子中五味子乙素為例，UPLC-Q-Orbitrap MS測定的保留時(shí)間為31.44 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z401.194 5[M+H]+，其產(chǎn)生的特征二級離子碎片有m/z369.169 1，為[M+H-CH4O]+，是五味子乙素的特征碎片；結(jié)合數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)報(bào)道，該碎片與五味子乙素的理論裂解碎片相似度高，推測該結(jié)構(gòu)為五味子乙素。五味子乙素的總離子流圖、二級質(zhì)譜解析及裂解規(guī)律見圖6。

補(bǔ)肺益腎方由人參、黃芪、赤芍、浙貝母、醋五味子、炒紫蘇子、陳皮、淫羊藿(炙)、矮地茶、酒萸肉、枸杞、地龍12味中藥組成。人參、黃芪中多含皂苷類成分，負(fù)離子模式測定的響應(yīng)較高，負(fù)離子模式下共鑒定出37個(gè)成分，其中人參皂苷類23個(gè)，黃芪皂苷類11個(gè)；正離子模式下只鑒定出人參皂苷2個(gè)，黃芪皂苷2個(gè)成分。赤芍主要含有芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷等單環(huán)倍半萜類成分，浙貝母主要含有生物堿類成分，醋五味子主要含有木質(zhì)素類成分，陳皮、矮地茶、淫羊藿(炙)主要含有黃酮醇類成分，酒萸肉主要含有環(huán)烯醚萜類成分，均在正離子模式下響應(yīng)較大，正離子模式下共鑒定出 205種成分。浙貝母、醋五味子、炒紫蘇子、陳皮、淫羊藿(炙)、矮地茶、酒萸肉藥材中的成分測定較為合理，對于今后的研究具有較高的參考價(jià)值。

圖5 淫羊藿苷的總離子流圖(A)、二級質(zhì)譜裂解圖(B)與裂解規(guī)律(C)Fig.5 TIC(A)，secondary mass spectrum(B)and proposed fragmentation pathways(C) of icarrin

3 結(jié) 論

本研究應(yīng)用UPLC-Q-Orbitrap MS法快速定性分析了補(bǔ)肺益腎方的主要化學(xué)成分，通過應(yīng)用Xcalibur軟件匹配元素組成(誤差值<5×10-6)，Chem Spider數(shù)據(jù)庫查找結(jié)構(gòu)式，Mass Frontier 6.0軟件對結(jié)構(gòu)式裂解，比對測定的二級碎片與理論碎片的相似度進(jìn)一步推測其可能的化學(xué)成分。該方法可行性強(qiáng)，結(jié)果可信度高，為補(bǔ)肺益腎方在血清中的藥物化學(xué)研究提供了參考，對于該復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究具有較高的應(yīng)用價(jià)值。