慢性乙型肝炎患者血清miR-21水平對(duì)肝纖維化程度的評(píng)估價(jià)值

李文庭 趙宗豪 李宜

肝纖維化是各種慢性肝病包括乙型肝炎發(fā)展成為肝硬化和肝癌的必經(jīng)階段。早期肝纖維化是可逆的[1-2]。因此，早期準(zhǔn)確診斷肝纖維化對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要的意義。

肝臟病理是肝纖維化分期的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，其有創(chuàng)性以及不可重復(fù)性限制了臨床應(yīng)用。同時(shí)，取材以及讀片的誤差使得肝臟病理并不能完全準(zhǔn)確地反映肝纖維化程度。基于此，近年來(lái)，學(xué)者們又開(kāi)發(fā)出了多種無(wú)創(chuàng)診斷方法，包括瞬時(shí)彈性成像(TE)等[3]，但這些檢測(cè)易受多種因素的影響，如患者體型，肝功能(炎癥)，體位等[4]。而前期研究結(jié)果顯示，經(jīng)典血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，如HA、PCⅢ、CⅣ、LN，F(xiàn)IB-4等，其靈敏度和特異度均較低[5]。因此，學(xué)者們不斷地尋找新的無(wú)創(chuàng)診斷指標(biāo)。

微小RNA (micro RNA，miR) 是一類(lèi)高度保守的非編碼RNA分子，長(zhǎng)度約為18～22 nt，能調(diào)控基因表達(dá)，具有廣泛的生物學(xué)效能。miR-21被證實(shí)在肝纖維化以及肝癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[6]。然而，關(guān)于miR-21在慢性乙型肝炎患者疾病發(fā)展過(guò)程中是否發(fā)揮作用，以及血清miR-21水平能否評(píng)估肝纖維化分期，尚無(wú)相應(yīng)研究。本研究納入73例慢性乙型肝炎患者，檢測(cè)血清miR-21水平，并分析其與肝纖維化分期的相關(guān)性，探索其診斷價(jià)值，報(bào)道如下。

資料和方法

一、材料

(一) 一般資料 納入2014年7月至2018年4月在我院感染科住院的慢性乙型肝炎患者73例。其中男性48例，女性25例，平均年齡(41.8±12.0)歲?；颊呔稀堵砸倚透窝追乐沃改稀返脑\斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)其他嗜肝病毒感染，如甲型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎；(2)酒精性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝炎、脂肪肝等；(3)合并原發(fā)性肝癌或轉(zhuǎn)移性肝癌；(4)其他病因?qū)е碌母闻K慢性病變，如血吸蟲(chóng)肝病，肝血管瘤，布加綜合征等。所有患者均簽署知情同意書(shū)，且獲安徽省立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

(二)材料試劑 RNA 抽提試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司(北京)，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及qPCR試劑盒購(gòu)于金斯瑞生物科技有限公司(南京)。

二、方法

(一)病毒學(xué)以及生化指標(biāo)檢測(cè) 所有患者均進(jìn)行血常規(guī)，血生化以及乙型肝炎病毒學(xué)檢測(cè)，由我院檢驗(yàn)科完成。

(二) 肝穿刺以及病理學(xué)檢查 73例慢性乙型肝炎患者均行肝臟病理檢查。肝穿刺在B超引導(dǎo)下進(jìn)行，采集的肝組織標(biāo)本由我院病理科包埋，切片。對(duì)組織切片進(jìn)行HE以及Masson's 染色，并由2位病理醫(yī)生獨(dú)立閱片進(jìn)行肝纖維化分期。具體分期標(biāo)準(zhǔn)參照2015年頒布的《慢性乙型肝炎防治指南》纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)[7]。

(三) qPCR檢測(cè)患者血清miR-21水平 逆轉(zhuǎn)錄按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，取2 μg RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，引物 2 μL， dNTP 0.8 μL,Bufffer 2 μL，加ddH2O配成20 μL體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。具體條件為：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min ，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后4 ℃保存。

qPCR按照相關(guān)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，取cDNA 2 μL, 加入qPCR Mix 10 μL，引物各2 μL，ddH2O 4 μL。qPCR在 Applied Biosystems 7 500中完成。具體條件為：95.0 ℃，10 min；95.0 ℃，10 s；60.0 ℃，20 s；72.0℃，10 s，35個(gè)循環(huán)；使用2-△△Ct法計(jì)算miR-21的表達(dá)量。miR-21引物為：Forward，5′-ACGTTGTGTAGCTTAT CAGACTG-3′，Reverse 5′-AATGGTTGTTCTCCA CACTCTC-3′。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、 73例慢性乙型肝炎患者一般資料

對(duì)73例患者一般資料進(jìn)行了分析：年齡為 (41.8±12.0)歲；ALT 為(41.7±38.5) IU/L；AST為(29.7±17.6) IU/L；按照血清病毒定量分組(lg拷貝數(shù)/mL，<3, 3～5, >5)，各組例數(shù)分別為 27、16、30。

二、 73例患者血清miR-21的表達(dá)

根據(jù)病理學(xué)檢查，73例患者肝纖維化分期為F0(6例)，F(xiàn)1 (29例), F2(23例), F3(10例), F4(5例)。各組患者血清miR-21表達(dá)：F0為0.702±0.105; F1為0.881±0.330; F2為1.234±0.340; F3為1.441±0.255; F4為1.762±0.212。相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清miR-21水平與肝纖維化分期呈顯著正相關(guān)(r=0.683，P<0.05)，與乙型肝炎病毒量無(wú)顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.416，P<0.05)。

三、 ROC曲線分析血清miR-21的診斷效能

為明確miR-21對(duì)慢性乙型肝炎患者的肝纖維化診斷效能，使用ROC曲線分析。結(jié)果表明，分別以血清miR-21值 ≥0.9835，≥1.150和≥1.557為cut-off值診斷F2、F3及F4，其曲線下面積分別為0.860 (95%CI, 0.774～0.946)，0.854(95%CI, 0.768～0.940), 0.929(95%CI, 0.8648～0.995)，見(jiàn)表1。

表1 血清miR-21診斷慢性乙型肝炎肝纖維化的診斷

(A)隨著肝纖維化程度的增加，血清miR-21表達(dá)升高; (B)隨著病毒載量增加，血清miR-21表達(dá)升高；*P<0.05

討 論

肝臟受到損傷時(shí)，肝細(xì)胞以及小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀再生[8]。同時(shí)，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)活化，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular Matrix，ECM)沉積在肝臟，分隔包圍再生肝細(xì)胞，形成假小葉。因此，HSC 活化是肝纖維化的核心機(jī)制[9]。在慢性乙型肝炎過(guò)程中，免疫細(xì)胞活化并釋放大量的細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)[10]，加速肝纖維化的形成。

miR-21已被證實(shí)在TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。TGF-β1 體外能誘導(dǎo)miR-21-5p表達(dá)，而體外高表達(dá)miR-21-5p后，TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化進(jìn)程加速，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)miR-21-5p表達(dá)。與其他病因不同，乙型肝炎肝纖維化有著獨(dú)特的發(fā)病機(jī)制。目前研究顯示HBx基因能上調(diào)肝細(xì)胞miR-21表達(dá)[10]，這也解釋了單純拮抗TGF-β1并不能有效地抑制乙型肝炎肝纖維化[11]。這也為miR-21成為乙型肝炎肝纖維化的診斷指標(biāo)提供了理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，隨著肝纖維化分期的升高，患者血清miR-21水平逐漸增加，兩者具有顯著正相關(guān)關(guān)系。隨著血清病毒載量升高，患者血清miR-21水平逐漸增加，兩者有顯著正相關(guān)關(guān)系，值得進(jìn)一步研究。使用ROC曲線進(jìn)一步探索miR-21的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示以血清miR-21值 ≥0.9835，≥1.150和≥1.557為cut-off值診斷F2、F3及F4，其曲線下面積分別為0.902，0.875, 0.884。與前期結(jié)果相比，血清miR-21對(duì)肝纖維化的診斷效能明顯高于HA, PCⅢ, CⅣ和LN診斷。因此，可認(rèn)為血清miR-21具有較好的肝纖維化診斷價(jià)值。

肝纖維化分期對(duì)慢性乙型肝炎治療方案的制定以及療效隨訪具有重要的臨床意義。相對(duì)于肝臟穿刺組織病理學(xué)檢查而言，血清學(xué)檢查簡(jiǎn)單、快速、無(wú)創(chuàng)傷，可重復(fù)性高，亦可避免肝穿刺的取材誤差。同時(shí)，血清miR-21可反映患者體內(nèi)病毒復(fù)制狀態(tài)。因此，本研究結(jié)果提示可以通過(guò)乙型肝炎患者血清miR-21水平評(píng)價(jià)肝纖維化的分期。

本研究尚存在一些不足，病例數(shù)偏少，且缺乏長(zhǎng)時(shí)間隨訪觀察。因此，今后需要擴(kuò)大樣本量，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，從而進(jìn)一步優(yōu)化血清miR-21的診斷效能，為該指標(biāo)的臨床應(yīng)用提供充分的理論支持。