骨穿刺活檢針制作的乳腺癌組織芯片中Gankyrin的表達(dá)*

張小容 徐 曉 程 林

(九江學(xué)院附屬醫(yī)院 江西九江 332000)

乳腺癌已經(jīng)超過肺癌成為全世界女性最常見的惡性腫瘤，在歐美國家乳腺癌的發(fā)病率占女性惡性腫瘤發(fā)病的首位。目前，中國雖屬乳腺癌低發(fā)國家，但隨著社會經(jīng)濟水平發(fā)展及人們生活方式西方化改變，其發(fā)病率增長迅猛。同時中國人口基數(shù)大，而且發(fā)病高峰年齡較歐美國家偏低，這些因素促使中國乳腺癌發(fā)病例數(shù)快速增加，嚴(yán)重威脅著廣大女性的健康和生命。盡管乳腺癌治療方法眾多，靶向治療仍然是主要治療手段之一。選擇可能的分子靶點，應(yīng)用靶向藥物實施個體化治療將是乳腺癌治療的主要趨勢，因此檢測乳腺癌中可能的藥物治療靶點成為最主要的研究方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2010-2016年九江學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔的臨床病理資料齊全的乳腺癌標(biāo)本73例，患者均為女性，年齡30～65歲，中位年齡49歲。所以患者術(shù)前均未行放療、化療等抗腫瘤治療。

1.2 主要試劑

兔Gankyrin單克隆抗體(貨號：SC-101498)購于美國santa Gruz公司，P53(DO-7)即用型快捷免疫組化Max Vision試劑盒及DAB顯示試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 組織芯片的制作 收集73例乳腺癌組織蠟塊和24例腺病組織蠟塊，首先進行切片HE染色，并進行形態(tài)學(xué)觀察，在蠟塊上選取組織結(jié)構(gòu)完好，具有代表性的病變部位用標(biāo)記筆畫圈作出標(biāo)記。制作3個3.7cm×2.4cm×0.7cm大小的空白蠟塊，設(shè)計成5×8的組織微列陣。用骨穿刺活檢針(見圖1)針管打孔制成受體模塊，孔徑 2.0mm。用穿刺針從供體蠟塊標(biāo)記部位逐個取出組織芯，隨即放入預(yù)先制備的受體模塊中，每個模塊起始端第一排分別用肝癌、腎、脾、甲狀腺、淋巴結(jié)各1例作為定位標(biāo)記和對照。將受體模塊至于玻片上54℃恒溫箱加熱30min(每隔10min觀察一次，避免時間太長，引起受體模塊中的石蠟融化太多，引起組織偏移原本的位置)，使組織芯片和受體蠟塊相互融合，以玻片上出現(xiàn)一層薄薄的液體石蠟為宜。再用寫好標(biāo)記的組織包埋盒將含組織芯片的蠟塊整個再次包埋，室溫放置30min后冷凍30min(避免包埋后直接冷凍，溫差太大，容易造成組織芯與受體模塊脫離)，4μm切片。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 采用Max Vision法，參照試劑說明書操作。簡要步驟：4μm厚石蠟切片常規(guī)脫蠟水化；檸檬酸鈉緩沖液高壓修復(fù)，濃縮型一抗用抗體稀釋液稀釋，P53、Gankyrin的稀釋度分別為1∶100和1∶50。4℃過夜，滴加二抗，DAB顯色，復(fù)染，脫水，封片。用PBS液代替一抗作陰性對照。

1.3.3 結(jié)果判定 判斷標(biāo)準(zhǔn)：①Gankyrin蛋白是細(xì)胞漿、胞核呈黃色或棕黃色被判定為陽性信號，P53定位于細(xì)胞核，著色強度無、弱、一般及強陽性分別為0、1、2及3分。②著色細(xì)胞比例0、<25%、25%～50%、50%～75%、>75%分別計分為0、1、2、3、4 分。③著色強度與著色細(xì)胞比例兩組分值相加<3 被認(rèn)為陰性(-)，≥3被認(rèn)為陽性(+)。染色結(jié)果由兩位副主任以上職稱的病理醫(yī)師閱片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。樣本率的比較應(yīng)用χ2檢驗，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨穿刺活檢針

骨穿刺活檢針(見圖1)用于取樣2mm直徑組織樣本。A主要用于打受體模塊的組織孔及取樣，針芯B將所取的組織芯片取出來。制備的組織芯片，陣列保持良好，標(biāo)記位置清晰可見，偶有移位現(xiàn)象，組織芯與蠟塊表面沒有明顯凹凸不平現(xiàn)象，切片HE染色組織排列尚整齊，偶有移位及掉片(見圖2)。

圖1 骨穿刺活檢針

圖2 組織芯片切片(HE染色)

由圖2可見，組織芯片經(jīng)切片染色后整體保存較完整，偶有移位及掉片。

2.2 Gankyrin、P53蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)

Gankyrin主要表達(dá)于乳腺癌的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中(見圖3)，P53表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(見圖4)。73例乳腺癌組織中Gankyrin及P53的陽性率分別為60.2%、27.4%；24例乳腺腺病組織中Gankyrin及P53的陽性率分別為4.0%、0。Gankyrin及P53在乳腺癌及乳腺腺病組織中表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)(見表1)。

圖3 乳腺癌組織中Gankyrin的表達(dá)(Max Vision法10×)

圖4 乳腺癌組織中P53的表達(dá)(Max Vision法 10×)

分組nGankyrin - + χ2 p值 p值 - + χ2 p值 乳腺癌組織73294422.863<0.0153206.6940.01腺病2423 1240

注：p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

組織芯片技術(shù)[1](tissue chip，Tc)又稱為組織微陣列(tissue microarray， TMA)，是將10個以上組織樣本，有序地排列在同一張載玻片上，而形成的微縮組織切片進行組織學(xué)研究。由于芯片的制作能大大降低實驗成本及工作量，而且實驗結(jié)果可靠，能明顯降低實驗誤差等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究及免疫組化陽性對照的建立。目前組織芯片的制作有商品化的組織芯片儀及手工制作兩種方法，但前者價格昂貴，應(yīng)用受限。因此，手工制作芯片應(yīng)用更廣泛[2]。

該實驗運用骨穿刺活檢針成功制作了乳腺癌組織芯片。該芯片組織直徑2mm，能確保足夠量的組織進行實驗，相比較于組織微陣列制作儀制作的直徑0.9mm的組織芯片[3]而言能容納更多的組織，提高實驗的成功率，而且該方法成本低，可廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究及免疫組化陽性組織芯片的制作。

癌性錨蛋白重復(fù)序列(Gankyrin)又稱為PSMD10、p28、Nas6p，是2000年由日本學(xué)者Higashitsuji等[4]肝癌組織發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因。它屬于錨蛋白家族成員，由7個錨蛋白重復(fù)序列組成，大小為25KDa，包括226個氨基酸，定位于人染色體xq22.3，在哺乳動物中高度保守[5-6]。近年來，研究者相繼對胰腺癌[7]、膀胱尿路上皮癌[8]、結(jié)直腸癌[9]等進行研究發(fā)現(xiàn)，Gankyrin在這些腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。該實驗研究發(fā)現(xiàn)Gankyrin在乳腺癌中高表達(dá)，陽性率為60.2%，與正常乳腺組織相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。p53作為一種抑癌基因，幾乎存在于所有腫瘤細(xì)胞中，該實驗研究表明，P53在乳腺癌組織中陽性率為27.4%，而在正常乳腺組織中無表達(dá)。有相關(guān)研究表明Gankyrin可與細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)及鼠雙微體基因表達(dá)產(chǎn)物(MDM2)相結(jié)合，介導(dǎo)Rb引起的P53泛素化降解，是促進惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制其凋亡[10-11]。

綜上所述，Gankyrin在乳腺癌中高表達(dá)，可能會促進腫瘤的增殖，抑制腫瘤凋亡，影響患者預(yù)后。在后續(xù)的實驗研究中，將重點分析Gankyrin與臨床特征的關(guān)系，以及與P53的相關(guān)性進行分析。