不同培養(yǎng)條件對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響*

林 健 林志立 魏文珺 甘小翠

(莆田學(xué)院藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 福建莆田 351100)

金黃色葡萄球菌是人類(lèi)的一種重要病原菌，具有強(qiáng)大的形成生物被膜(biofilm，BF)的能力[1]。根據(jù)美國(guó)NIH統(tǒng)計(jì)，超過(guò)80%的人類(lèi)感染性疾病是由細(xì)菌生物膜介導(dǎo)的[2]，例如金黃色葡萄球菌引起的導(dǎo)管相關(guān)感染[3]、下呼吸道流感嗜血桿菌生物被膜的形成與慢性阻塞性肺疾患急性發(fā)作相關(guān)性[4]等，在這些細(xì)菌中，金黃色葡萄球菌引起的感染僅次于大腸桿菌，由此可見(jiàn)其致病能力。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)界對(duì)某些環(huán)境中常見(jiàn)細(xì)菌所致的一些慢性和頑固性疾病的深入了解，發(fā)現(xiàn)以生物被膜形式存在的細(xì)菌不同于浮游細(xì)菌，它們對(duì)抗生素等殺菌劑、惡劣環(huán)境及宿主免疫防御機(jī)制有著很強(qiáng)的抗性。此外，其產(chǎn)生的腸毒素可污染食物而致食物中毒，為人類(lèi)帶來(lái)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。

生物被膜是指細(xì)菌附著于生物或非生物的接觸表面生長(zhǎng)，分泌多糖、蛋白質(zhì)等多聚物構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)，將其自身包裹其中而形成的大量細(xì)菌聚合物[5]。從成熟的生物被膜模型可以看出，從外到內(nèi)包括主體生物被膜層(bulk of biofilm)、連接層(linking film)、條件層(conditioning film)、基質(zhì)層(substratum)[6]。它的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，包括細(xì)菌起始粘附、BF發(fā)展和成熟等階段[7]。細(xì)菌生物被膜的形成不僅受自身基因的調(diào)控，還受其菌團(tuán)所處的外界環(huán)境如溫度、時(shí)間、PH、載體、營(yíng)養(yǎng)條件等影響。了解這些因素對(duì)生物被膜形成的影響，可為研究生物被膜的生理生化特征以及控制生物被膜的形成提供技術(shù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

金黃色葡萄球菌(ATCC25923)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)(北京奧星生物技術(shù)有限公司)；氯化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；結(jié)晶紫(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板(上海生工生物工程有限送死)；酶標(biāo)儀(日本Bio-Rad公司)；ZW-A微量振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司)；數(shù)顯恒溫振蕩器(金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的復(fù)蘇 取凍干保存的金黃色葡萄球菌劃線于普通瓊脂平板，在37℃溫箱中孵育24h，在挑取單個(gè)菌落接種于TSB中，37℃溫箱中培養(yǎng)12-16h。

1.2.2 玻璃試管法 將培養(yǎng)過(guò)夜的菌液用TSB培養(yǎng)基稀釋至麥?zhǔn)媳葷岫葹?.5，稀釋至菌落數(shù)為106cfu/mL無(wú)菌條件下吸取20μL菌懸液接種于2mL液體TSB中，將試管于37℃恒溫箱中分別培養(yǎng)1d、2d、3d、4d、5d，棄去培養(yǎng)液，用PBS漂洗3次，甲醇固定10min后，加入2.5mL 1%結(jié)晶紫室溫下染色30min，吸取試管中多余的結(jié)晶紫染色液后，在自來(lái)水下沖洗試管3～5min，倒置試管除去水份，自然烘干。肉眼觀察液面與空氣接觸處的玻璃試管壁。

1.2.3 結(jié)晶紫染色法半定量測(cè)定生物被膜形成量

(1)NaCl濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)的影響。采用含不同濃度NaCl(0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)的TSB培養(yǎng)基230uL和106cfu/mL菌液20μL混合后在96孔培養(yǎng)板進(jìn)行37℃，培養(yǎng)2d，平行實(shí)驗(yàn)3次。

(2)葡萄糖濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)的影響。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入含不同濃度的葡萄糖(0%、0.2%、0.5%、1%、2%、3%)的TSB培養(yǎng)基230μL和106cfu/mL菌液20μL混合后進(jìn)行37℃培養(yǎng)2d，平行實(shí)驗(yàn)3次。

(3)不同培養(yǎng)基濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)的影響。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入含不同濃度的TSB溶液(5%、20%、100%)230uL，并接入20μL和106cfu/mL金黃色葡萄球菌菌液，37℃培養(yǎng)2d，以250μL無(wú)菌水的孔作為對(duì)照。

(4)生物被膜光密度值(OD值)和粘附程度的測(cè)量。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用PBS漂洗3次，然后用250μL的甲醇固定10min。棄去固定液，用250μL 1%的結(jié)晶紫染色30min，用自來(lái)水沖洗除去多余的結(jié)晶紫，晾干；再向每孔加250μL的95%的乙醇，振蕩器上振搖10min以釋放生物被膜中的結(jié)晶紫，測(cè)定其在595nm處的吸光值，平行實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響

試管法不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響情況見(jiàn)圖1。

圖1 試管法不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，試管玻璃壁上被染色部分增多，顏色加深，2d后形成的生物被膜明顯，5d后最為明顯。

2.2 Nacl濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)的影響

NaCl濃度變化對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 NaCl濃度變化對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)的影響

從圖2可以看出，當(dāng)氯化鈉濃度越高時(shí)，金黃色葡萄球菌生物被膜的生長(zhǎng)能力反而越低。

2.3 葡萄糖濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)的影響

葡萄糖濃度變化變化對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖3。

圖3 葡萄糖濃度變化對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)的影響

由圖3可見(jiàn)，當(dāng)葡萄糖濃度>0.5%之后開(kāi)始趨于平緩，說(shuō)明葡萄糖對(duì)金光色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，但這種促進(jìn)作用是有限的。

2.4 不同培養(yǎng)基濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)的影響

不同培養(yǎng)基濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同培養(yǎng)基濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的影響

圖4表明，金黃色葡萄球菌生物被膜的OD值隨著培養(yǎng)基濃度的升高而增大。說(shuō)明富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境有利于金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。

3 討論

眾所周知，時(shí)間、營(yíng)養(yǎng)條件、溫度、鹽濃度、糖分等多種因素均能影響金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。金黃色葡萄球菌生物被膜在一定的條件下，2d后即可以形成較為穩(wěn)定的生物被膜。金黃色葡萄球菌在形成生物被膜的過(guò)程中，可對(duì)糖分進(jìn)行利用，因此糖分和低濃度的氯化鈉有利于金黃色葡萄球菌形成生物被膜，氯化鈉對(duì)其促進(jìn)作用是有限的，高濃度的氯化鈉會(huì)抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的生長(zhǎng)。因此，在臨床感染性疾病診療過(guò)程中，為有效防止金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，應(yīng)盡可能控制患者的血糖濃度，從而避免為金黃色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)提供溫床。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和民生的改善，食品、醫(yī)療安全已成為人們關(guān)注的重中之重，而給食品安全和公眾健康帶來(lái)巨大威脅和挑戰(zhàn)的病源微生物更是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。金黃色葡萄球菌形成生物被膜，使得對(duì)外界環(huán)境因素(殺菌消毒劑、高溫高鹽、強(qiáng)酸和抗生素等)刺激的抵抗性大大增強(qiáng)[8]，這為它產(chǎn)生免疫逃逸作用，寄居生存于醫(yī)療器械表面和機(jī)體粘膜提供了絕佳條件。文章通過(guò)在不同的條件下對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的生長(zhǎng)情況進(jìn)行研究可得，金黃色葡萄球菌生物被膜的生長(zhǎng)能力與培養(yǎng)條件有著十分密切的關(guān)系，培養(yǎng)時(shí)間、營(yíng)養(yǎng)條件、糖分、氯化鈉等均會(huì)對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的形成產(chǎn)生影響，這就為更好地控制金黃色葡萄球菌生物被膜的生長(zhǎng)提供了依據(jù)。