豬流行性腹瀉病毒S蛋白誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究

馬艷龍，薛 美，符 芳，尹靈丹，郭珊珊，馮 力，劉平黃

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所， 黑龍江 哈爾濱 150069)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由PED病毒(PEDV)引起的一種急性接觸性腸道傳染病。該病毒主要損傷豬的腸道黏膜，臨床上表現(xiàn)為水樣腹瀉、脫水、嘔吐為主要特征的急性腸炎。各個(gè)年齡段的豬均對(duì)PEDV易感，對(duì)一周齡以內(nèi)的仔豬危害最大，感染率和死亡率均在80%以上，給我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum，ER)是真核細(xì)胞內(nèi)分泌型和跨膜型蛋白合成、折疊、修飾和分選的主要場(chǎng)所，一旦其功能發(fā)生紊亂，就會(huì)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，激活由需肌醇酶Ⅰ(Inositol-requiring enzyme I，IRE1)、雙鏈 RNA依賴的蛋白激酶 R樣ERS(Protein kinase R-like ER kinase，PERK)和轉(zhuǎn)錄活化因子6(Activating transcription factor 6，ATF6)3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路來(lái)緩和ERS，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡，這些通路統(tǒng)稱為非折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response，UPR)[2]。近年來(lái)研究顯示，PEDV同別的冠狀病毒一樣，病毒復(fù)制和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)緊密相關(guān)，病毒復(fù)制期間合成的大量病毒蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行折疊加工修飾，結(jié)構(gòu)蛋白和基因組RNA復(fù)制完成后，將在宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處裝配生成新的冠狀病毒顆粒，并通過(guò)高爾基體分泌至細(xì)胞外，這個(gè)病毒感染過(guò)程常常導(dǎo)致宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生混亂，引起ERS[3-4]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose regulated protein 78KD，Grp78)是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的重要分子伴侶，其上調(diào)表達(dá)常作為ERS被激活的標(biāo)志[5]。

為了探究PEDV主要結(jié)構(gòu)蛋白S蛋白對(duì)細(xì)胞ERS的影響，本研究構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-S，轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞。結(jié)果顯示 PEDV S蛋白誘導(dǎo)了ERS并主要激活了PERK信號(hào)通路，激活的PERK通路反過(guò)來(lái)抑制了病毒的復(fù)制，為闡明S蛋白在PEDV的致病機(jī)理中的作用奠定了一定基礎(chǔ)，也為抗病毒藥物的設(shè)計(jì)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞、菌株及載體PEDV CV777疫苗株(KT323979)、Vero-E6細(xì)胞系和 pcDNA3.1(-)載體由本實(shí)驗(yàn)保存。感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑Primer STAR DNA高保真聚合酶、PrimeScrip Ⅱ 1st strand cDNA Synthese Kit、 DL2000 Marker購(gòu)自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；病毒RNA提取試劑盒和細(xì)胞總RNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；蛋白酶和磷酸酶抑制劑、NP-40細(xì)胞裂解液、BSA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；Lipofectamine 2000、Alexa Fluor 633山羊抗兔IgG抗體、Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG抗體和Alexa Fluor 546山羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；Tunicamycin(Tu)、Salubrinal(SA)和 DAPI購(gòu)自 Sigma公司；抗Grp78多克隆抗體、抗p-PERK單克隆抗體(MAb)、抗 p-eIF2α MAb、抗 ATF6多克隆抗體和抗 β-actin MAb購(gòu)自 Abcam公司；抗 PERK MAb和抗 eIF2α MAb購(gòu)自Santa Cruz公司；鼠抗PEDV疫苗株CV777 S蛋白MAb和N蛋白MAb由本實(shí)驗(yàn)室制備；IRDye800標(biāo)記的驢抗鼠IgG抗體和IRDye800標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體購(gòu)自LI-COR公司。

1.3 PEDV感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞ERS的檢測(cè)當(dāng)Vero-E6細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)用1 MOI PEDV感染細(xì)胞，分別于感染后6 h、12 h、24 h、36 h和48 h后收集樣品，設(shè)立Tunicamycin(Tu)陽(yáng)性對(duì)照組和DMSO陰性對(duì)照組。分別用熒光定量 PCR[6]和western blot方法檢測(cè)PEDV ORF3基因和Grp78編碼基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及PEDV N蛋白和ERS Grp78蛋白表達(dá)水平變化情況。

1.4 重組質(zhì)粒pcDNA-S的構(gòu)建與鑒定以PEDV CV777株感染的Vero-E6細(xì)胞提取的總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，根據(jù)GenBank中S全長(zhǎng)基因序列(JN599150.1)設(shè)計(jì)引物，并在其上、下游引物中分別引入KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(表 1)，PCR擴(kuò)增目的基因，克隆于pcDNA3.1(-)載體中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-S，通過(guò)酶切及測(cè)序?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 PEDV S蛋白表達(dá)的western blot鑒定將pcDNA-S轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞，同時(shí)設(shè)pcDNA3.1(-)載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，裂解，SDS-PAGE電泳后，以抗 S蛋白 MAb(1∶500)為一抗，IRDye800標(biāo)記的驢抗鼠IgG抗體(1∶10 000)為二抗進(jìn)行western blot檢測(cè)PEDV S蛋白的表達(dá)。

1.6 PEDV S蛋白的表達(dá)和間接免疫熒光(IFA)鑒定將pcDNA-S轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞，同時(shí)設(shè)pcD-NA3.1(-)載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48 h后，用4%的多聚甲醛固定30 min、0.05%TritonX-100通透15 min、5%脫脂乳37℃封閉2 h后，以1∶500稀釋的鼠抗S蛋白MAb為一抗，1∶500倍稀釋的Alexa Fluor 546山羊抗鼠IgG抗體為二抗，DAPI染色10 min后，以IFA檢測(cè)PEDV S蛋白的表達(dá)。

表1 擴(kuò)增和檢測(cè)引物Table 1 Primers used to amplify and detect the target genes

1.7 ERS標(biāo)志蛋白Grp78的檢測(cè)將pcDNA-S轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞，同時(shí)設(shè)pcDNA3.1(-)載體對(duì)照組、Tunicamycin(Tu)陽(yáng)性對(duì)照組和DMSO陰性對(duì)照組。于轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，分別用熒光定量PCR[6]檢測(cè)Grp78的mRNA水平變化情況和以抗Grp78多克隆抗體(1∶1 000)和抗 β-actin MAb(1∶500)為一抗，IRDye800標(biāo)記的驢抗鼠 IgG抗體(1∶1 000)或者IRDye800標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體(1∶1 000)為二抗進(jìn)行western blot檢測(cè)Grp78蛋白表達(dá)水平變化情況。

1.8 S蛋白與 Grp78蛋白的定位分析將 1 μg pcDNA-S轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞36 h后，分別孵育鼠抗S蛋白MAb、兔抗 Grp78多克隆抗體，經(jīng)PBST洗滌后，再分別孵育 1∶500倍稀釋的 Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG抗體和1∶500倍稀釋的Alexa Fluor 633山羊抗兔 IgG抗體，DAPI染色后使用激光共聚焦顯微鏡分析S蛋白和內(nèi)源性Grp78的定位情況。

1.9 S蛋白對(duì)UPR信號(hào)通路激活的檢測(cè)將pcDNA-S轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞，同時(shí)設(shè)pcDNA3.1(-)載體對(duì)照組、1 μM的 Tunicamycin(Tu)處理的陽(yáng)性對(duì)照組和DMSO處理的陰性對(duì)照組。于轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，以抗 PERK MAb(1∶1 000)、 p-PERK MAb(1 ∶1 000)、 eIF2α MAb(1 ∶1 000)、 p-eIF2α MAb(1 ∶500)、 ATF6 MAb(1 ∶1 000)和 抗 β-actin MAb(1∶500)為一抗，IRDye800標(biāo)記的驢抗鼠 IgG抗體(1∶10 000)或者 IRDye800標(biāo)記的驢抗兔 IgG抗體(1∶10 000)為二抗進(jìn)行 western blot檢測(cè) PERK和ATF6信號(hào)通路的激活情況；同時(shí)將細(xì)胞提取總mRNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，通過(guò)PCR擴(kuò)增剪切的與未剪切的XBP1，隨后用PstⅠ酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)IRE1信號(hào)通路的激活情況。

1.10 Salubrinal(SA)處理后PEDV感染的檢測(cè)用100 nM的Salubrinal(SA)預(yù)處理長(zhǎng)成單層的Vero-E6細(xì)胞2 h，同時(shí)設(shè)DMSO處理組為陰性對(duì)照組，1 μM的Tunicamycin(Tu)處理組為陽(yáng)性對(duì)照組；隨后用MOI=1的PEDV感染，37℃吸附2 h，DMEM洗3遍，分別加入含有上述藥物的DMEM維持液，37℃培養(yǎng)36 h，收集細(xì)胞，分別用熒光定量PCR[6]和TCID50檢測(cè)PEDV感染情況。

2 結(jié)果

2.1 PEDV感染誘導(dǎo)ERS檢測(cè)結(jié)果用PEDV感染Vero-E6細(xì)胞后，分別采用熒光定量PCR和western blot檢測(cè) PEDV ORF3基因和 Grp78編碼基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，以及PEDV N蛋白和ERS標(biāo)志蛋白Grp78的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，PEDV感染后隨著感染時(shí)間的推移，PEDV ORF3基因和Grp78編碼基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，以及PEDV N蛋白和Grp78的蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)(圖1)。結(jié)果表明，PEDV感染能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞ERS。

圖1 利用 RT-qPCR(A和 B)和 western blot(C)檢測(cè)PEDV N蛋白和ERS標(biāo)志蛋白Grp78 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的表達(dá)Fig.1 The expression of PEDV N protein and ER stress marker protein Grp78 detected by RT-qPCR(A and B)and western blot(C)

2.2 PEDV S蛋白在Vero-E6細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及鑒定將pcDNA-S轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞，利用western blot檢測(cè)S蛋白的表達(dá)情況，β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA-S質(zhì)粒的細(xì)胞在約300 ku處檢測(cè)到預(yù)期大小的條帶，而空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組在相應(yīng)位置處沒(méi)有出現(xiàn)條帶(圖2A)。同樣用S蛋白抗體和Alexa Fluor 546山羊抗鼠IgG抗體通過(guò)IFA檢測(cè)S蛋白的表達(dá)情況，同時(shí)用DAPI染核后確定S蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA-S質(zhì)粒的細(xì)胞能夠觀察到紅色熒光，而空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組未察到紅色熒光，S蛋白與DAPI染的細(xì)胞核未發(fā)生共定位(圖2B)。以上結(jié)果表明，pcDNA-S質(zhì)粒能夠在Vero-E6細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá)S蛋白。

圖2 PEDV S蛋白表達(dá)的western blot(A)和IFA(B)鑒定Fig.2 Identification of the S protein expression of PEDV by western blot(A)and IFA(B)

2.3 PEDV S蛋白誘導(dǎo)了宿主細(xì)胞ERS將pcDNA-S質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞，用熒光定量PCR和western blot檢測(cè)ERS標(biāo)志蛋白Grp78的表達(dá)變化，同時(shí)用激光共聚焦試驗(yàn)檢測(cè)S蛋白和內(nèi)源性Grp78蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。結(jié)果顯示，pcDNA-S轉(zhuǎn)染組和Tunicamycin(Tu)處理組 Grp78的表達(dá)在mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平相對(duì)于pcDNA3.1(-)載體轉(zhuǎn)染組和DMSO處理組均明顯上調(diào)，而外源性表達(dá)的S蛋白和內(nèi)源性的Grp78存在共定位現(xiàn)象(圖3)。結(jié)果表明，PEDV S蛋白能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生ERS。

圖3 利用RT-qPCR(A)和western blot(C)檢測(cè)ERS標(biāo)志蛋白Grp78的表達(dá)及用激光共聚焦試驗(yàn)(B)檢測(cè)S蛋白和內(nèi)源性Grp78的定位情況Fig.3 The expression of ER stress marker protein Grp78 detected by RT-qPCR(A)and western blot(C)and the colocalization of S protein with endogenous Grp78 identified by confocal images(B)

2.4 PEDV S蛋白對(duì)UPR信號(hào)通路的影響將pcDNA-S質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞，通過(guò)western blot檢測(cè)PERK通路中PERK和eIF2α磷酸化水平來(lái)檢測(cè)PERK通路激活情況；通過(guò)western blot檢測(cè)ATF6蛋白的蛋白酶切割水平來(lái)檢測(cè)ATF6通路的激活情況；通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PstⅠ酶切XBP1后的產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)IRE1通路激活情況。結(jié)果顯示，pcDNA-S轉(zhuǎn)染組和Tunicamycin(Tu)處理組PERK和eIF2α的磷酸化水平相對(duì)于pcDNA3.1(-)載體轉(zhuǎn)染組和DMSO處理組明顯增加(圖 4A和4B)；pcDNA-S轉(zhuǎn)染組相對(duì)于pcDNA3.1(-)載體轉(zhuǎn)染組ATF6蛋白未發(fā)生明顯蛋白酶切割，而Tunicamycin(Tu)處理組相對(duì)于DMSO處理組發(fā)生明顯蛋白酶切割現(xiàn)象(圖4C)；pcDNA-S轉(zhuǎn)染組相對(duì)于pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染組XBP1轉(zhuǎn)錄本的剪切未發(fā)生明顯變化，而Tunicamycin(Tu)處理組相對(duì)于DMSO處理組發(fā)生明顯剪切(圖 4D)；結(jié)果表明，PEDV S蛋白主要激活UPR通路中的PERK信號(hào)通路。

圖4 利用western blot檢測(cè)PERK通路中PERK與eIF2α的磷酸化水平(A和B)和ATF6通路中ATF6蛋白(C)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PstⅠ酶切后的XBP1產(chǎn)物(D)Fig.4 The phosphorylation levels of PERK and eIF2α(A and B)in the PERK pathway and ATF6(C)in the ATF6 pathway detected by western blot,the XBP1 product after PstⅠdigestion detected by agarose gel electrophoresis(D)

2.5 藥物Salubrinal增強(qiáng)PERK通路后對(duì)PEDV感染的影響檢測(cè)經(jīng)典ERS誘導(dǎo)劑Tu處理細(xì)胞后對(duì)PEDV復(fù)制的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tu處理能夠明顯抑制PEDV在Vero-E6細(xì)胞中的復(fù)制，顯示ERS抑制PEDV復(fù)制。同時(shí)使用能夠選擇性增加PERK信號(hào)通路激活的藥物Salubrinal(SA)預(yù)處理Vero-E6細(xì)胞2 h后以1MOI的PEDV感染細(xì)胞，36 h后收集細(xì)胞，通過(guò)熒光定量PCR和TCID50檢測(cè)PEDV感染情況，確定Salubrinal(SA)增強(qiáng)PERK信號(hào)通路后對(duì)PEDV復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，Salubrinal(SA)處理組能夠明顯抑制PEDV在Vero-E6細(xì)胞中的復(fù)制(圖5)。表明藥物Salubrinal(SA)增強(qiáng)PERK信號(hào)通路后抑制了PEDV的復(fù)制。

圖5 利用 RT-qPCR(A)和 TCID50(B)檢測(cè) Salubrinal處理后對(duì)PEDV的感染的影響Fig.5 The effect of Salubrinal treatment on PEDV infection detected by RT-qPCR(A)and TCID50(B)

3 討論

真核細(xì)胞內(nèi)，大多數(shù)分泌型和跨模型蛋白的折疊、成熟和修飾發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，在生理狀態(tài)下，由于細(xì)胞分化、增殖和周圍環(huán)境的變化與細(xì)胞的生理狀態(tài)使得進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白量會(huì)有很大的變化；同樣的在一些病理狀態(tài)下，比如：營(yíng)養(yǎng)缺乏、缺氧、氧化還原、糖基化和鈣離子動(dòng)員紊亂等狀態(tài)下均會(huì)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力超負(fù)荷，引起ERS。為了根據(jù)細(xì)胞需求快速調(diào)整內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力，細(xì)胞激活了稱作非折疊蛋白應(yīng)答(UPR)的信號(hào)通路來(lái)緩和ERS，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的平衡，如果ERS平衡不能夠通過(guò)自身調(diào)節(jié)恢復(fù)，機(jī)體將會(huì)誘導(dǎo)凋亡來(lái)清除受損細(xì)胞。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種病毒感染細(xì)胞后同樣能夠誘導(dǎo)ERS，激活OPR，并最終影響到病毒復(fù)制。如非洲豬瘟病毒感染宿主細(xì)胞后引起ERS，主要激活UPR信號(hào)通路中的ATF6通路促進(jìn)病毒復(fù)制[7]；而西尼羅熱病毒感染宿主細(xì)胞后激活UPR信號(hào)通路中的所有3條信號(hào)通路來(lái)抑制病毒的復(fù)制[8]。

最新研究表明，許多冠狀病毒感染后可以引起宿主細(xì)胞發(fā)生 ERS，如 SARS、IBDV等[9-11]。Tong等也報(bào)道PEDV感染宿主細(xì)胞同樣能夠引起ERS，并最終抑制病毒的復(fù)制[3]，與本研究中PEDV感染能夠誘導(dǎo)ERS結(jié)果一致。也有關(guān)于PEDV感染后病毒E蛋白和N蛋白引起ERS，激活UPR的報(bào)道[12-14]，但對(duì)于PEDV最大的結(jié)構(gòu)蛋白S蛋白在病毒感染過(guò)程中能否引起ERS，激活UPR卻缺乏研究和分析。

因此，本研究構(gòu)建了PEDV結(jié)構(gòu)蛋白S蛋白的真核表達(dá)載體，并展開(kāi)相關(guān)研究。結(jié)果顯示，S蛋白能夠上調(diào)細(xì)胞中ERS標(biāo)志蛋白Grp78的表達(dá)并且二者在細(xì)胞內(nèi)具有共定位現(xiàn)象，表明S蛋白合成后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)折疊加工修飾，進(jìn)而積聚誘導(dǎo)了Grp78的上調(diào)表達(dá)。此外本研究還發(fā)現(xiàn)S蛋白主要激活UPR信號(hào)通路中的PERK通路，使PERK和 eIF2α的磷酸化水平明顯增加，而對(duì)ATF6的蛋白酶切割水平和IRE1通路中XBP1轉(zhuǎn)錄本的剪切作用卻沒(méi)有明顯影響，表明S蛋白沒(méi)有激活A(yù)TF6和IRE1通路，用特異性增強(qiáng)PERK信號(hào)通路激活的藥物Salubrinal[15]處理能夠抑制病毒的復(fù)制，提示PEDV感染后由S蛋白誘導(dǎo)的ERS可能通過(guò)激活PERK通路的eIF2α的磷酸化降低病毒蛋白合成進(jìn)而抑制病毒感染，但關(guān)于S蛋白能否在PEDV感染的天然宿主細(xì)胞-小腸上皮細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)ERS、激活UPR信號(hào)通路以及別的PEDV流行株能否誘導(dǎo)ERS仍然需要進(jìn)一步的研究。