大熊貓?jiān)幢ｆ邔僬婢?Cyphellophora pluriseptata)的分離鑒定與致病性研究

馬曉平，姜堯章，張和民，古 玉，曹三杰，王承東，左之才，李德生，凌珊珊，夏介英，王平峰

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.中國大熊貓保護(hù)研究中心，四川 雅安 625000；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，四川 雅安 625014；4.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041)

大熊貓被公認(rèn)為自然遺產(chǎn)和活化石，其作為“國寶”在我國外交上發(fā)揮著重要作用。大熊貓真菌病主要侵害其皮毛，也可侵害其皮膚或深部器官，不僅影響其生長發(fā)育和外觀形象，而且降低抵抗力，增加發(fā)病率和死亡率。引起大熊貓皮膚病的病原種類不一，有石膏樣毛癬菌引發(fā)的體癬病，毛霉所致的脫毛癥，白色念珠菌引起體表紅疹。張悅天等通過致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大熊貓?jiān)词鄻有℃咦泳鷮π∈笃つw致病性強(qiáng)[1]。馬曉平等發(fā)現(xiàn)枝孢樣枝孢霉引起大熊貓?bào)w表水腫、脫毛等[2]。同時，也發(fā)現(xiàn)部分真菌引起大熊貓深部真菌感染。

暗色真菌是指菌絲和(或)孢子的細(xì)胞壁具有黑色素樣顏色的一組真菌，可引起人類皮膚甚至多種組織的感染[3]。暗色絲孢霉病是由一大組條件致病性暗色真菌引起的淺表組織、皮膚、角膜、皮下組織甚至系統(tǒng)性感染[4]。其病原真菌種類繁多,包含50余屬100余種暗色真菌,較重要的致病性暗色真菌包括鏈格孢、離蠕孢、斑替枝孢霉、旁孢霉、外瓶霉、裴氏著色霉、馬杜拉分支菌屬、瓶霉菌屬、足放線病菌屬、柱霉屬、皮炎瓶霉屬。預(yù)計(jì)仍然會有新的致病性暗色真菌被發(fā)現(xiàn)[5]。

暗色絲孢霉病的診斷通常是通過病原分離、孢子和菌絲的形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)特異性鑒定。取分泌物、膿液,最好是活組織進(jìn)行培養(yǎng)有助于確診。將標(biāo)本接種于沙氏瓊脂斜面上在25℃～30℃下培養(yǎng)4周，大多數(shù)致病真菌經(jīng)過1～2周均可形成可見菌落。菌落為絨毛樣或酵母樣，呈灰色、暗綠色、暗棕色或黑色。根據(jù)其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行鑒定[4]。大熊貓由暗色真菌枝孢樣枝孢霉引起的暗色絲孢霉病在之前已有報(bào)道[2]。

杯梗孢屬(Cyphellophora)真菌于1962年首次報(bào)道，并在人的皮膚和指甲中首次分離到Cyphellophora de Vries[6]。Vries等人于 1984年在人的皮膚和指甲中首次發(fā)現(xiàn)Cyphellophora pluriseptata[7]，隨后Bittencourt等人于 2002年報(bào)道由C.pluriseptata引起的患者左耳部大面積浸潤的一例皮下暗色絲孢霉病[8]。其余未見關(guān)于C.pluriseptata的其他研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從自然發(fā)病的大熊貓患病處皮屑中分離到了一株真菌，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的鑒定，結(jié)果其為C.pluriseptata，并對該菌進(jìn)行了小鼠致病性和藥敏試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)填補(bǔ)了國內(nèi)關(guān)于C.pluriseptata研究的空白，對大熊貓及人類的暗色絲孢霉病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 患病熊貓臨床表現(xiàn)及病料樣品采集某動物園一雌性大熊貓和同舍6月齡雙胞胎幼崽脫毛，皮膚增厚出現(xiàn)肉芽腫等臨床表現(xiàn)，其余精神食欲未見異常。脫毛區(qū)域用75%酒精消毒，用無菌刀片刮取患部至微微出血后取皮屑和被毛放置于無菌的黑色紙袋中密封，保存于4℃保溫袋中送實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑實(shí)驗(yàn)用SPF級昆明小鼠購自四川省中醫(yī)藥科學(xué)院。放線菌酮以及氯霉素購自Amresco公司；酵母基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)等分子生物學(xué)試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司；GreenView購自成都博瑞克生物技術(shù)有限公司；伏立康唑、氟康唑、氟胞嘧啶等藥敏紙片購自丹麥Rosco公司；含放線菌酮和氯霉素的沙堡弱氏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基、沙堡弱氏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(SDA)均按文獻(xiàn)報(bào)道的方法配制[1]。

1.3 患病大熊貓皮膚病的初步診斷無菌取大熊貓患處病健結(jié)合部皮屑、毛發(fā)數(shù)根，放置于載玻片上，滴加100 g/L KOH溶液兩滴后蓋上蓋玻片，靜置10 min鏡檢觀察是否存在真菌菌絲、孢子，及其形態(tài)和排列等，即可做出初步診斷[1]。

1.4 真菌的分離培養(yǎng)與純化將初步確診的真菌性皮膚病樣品接種到加入放線菌酮以及氯霉素的SDA培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察1次。1周后，將單菌落接種到SDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化，25℃培養(yǎng)，用以進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定、致病性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)。

1.5 真菌分離株的形態(tài)學(xué)鑒定取單菌落接種于SDA培養(yǎng)基中觀察菌落特征。用銅圈法制作菌株小培養(yǎng)以觀察菌絲以及孢子形態(tài)。待接種的菌株產(chǎn)生孢子后，輕輕取下蓋玻片置于載玻片上，利用棉蘭染色、鏡檢并拍照。

1.6 真菌分離株的分子生物學(xué)鑒定

1.6.1 引物的設(shè)計(jì)與合成真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer，ITS)通用引物 ITS1(5'-TCC GTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3')[2]由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.6.2 真菌ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增按照酵母基因組DNA提取試劑盒說明書提取已純化真菌菌落的DNA，以ITS1/ITS4為引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用50 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6.3 序列分析PCR產(chǎn)物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。將已測定序列提交至GenBank，并獲得序列號。在NCBI中用BLAST程序與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)基因序列進(jìn)行相似性分析，用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多重序列比較，并用近鄰結(jié)合法(Neighbor-joining method)構(gòu)建種系發(fā)生樹，并通過1 000次自展分析(Bootstrap)對種系發(fā)生樹進(jìn)行置信度檢測。

1.7 真菌分離株的動物致病性試驗(yàn)反復(fù)沖洗SDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d的真菌分離株菌落，并用無菌生理鹽水混勻制成濃度為1×107cfu/mL的菌懸液。將27只體況相近的6周齡～8周齡健康SPF昆明小鼠(雌雄不限)隨機(jī)分為A、B、C 3組，每組9只。A組為免疫抑制組，B組為免疫正常組，C組為空白對照組。飼養(yǎng)一周消除應(yīng)激反應(yīng)后，A組用環(huán)磷酰胺和青霉素鈉進(jìn)行免疫抑制，腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg和青霉素鈉15 mg/只，隔天注射一次，連續(xù)3次，B組和C組注射相同劑量的生理鹽水。A、B、C 3組再分別分為皮膚涂擦組A1、B1、C1，皮下注射組A2、B2、C2以及腹腔注射組 A3、B3、C3，每組3只。A1、B1組小鼠在實(shí)驗(yàn)前剪除背部約3 cm×2 cm的毛發(fā)。消毒后，用無菌粗砂紙磨破小鼠背部皮膚至點(diǎn)狀滲血為宜，然后涂布菌懸液，A2、B2組分別在小鼠皮下注射菌懸液0.1 mL，A3、B3組小鼠在腹腔注射0.1 mL菌懸液。C1組小鼠皮膚涂擦生理鹽水，C2組小鼠在皮下注射0.1 mL生理鹽水，C3組小鼠在腹腔注射0.1 mL生理鹽水。每日觀察接種處皮膚是否有紅斑、脫屑、結(jié)痂和毛發(fā)生長變化。若小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀導(dǎo)致提前死亡則將該小鼠解剖并取小鼠患部進(jìn)行逆培養(yǎng)，并提取真菌菌體DNA進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。感染后第7 d，統(tǒng)一迫殺并解剖小鼠，肉眼觀察主要器官的病變，并取接種處皮膚、病變明顯的臟器用10%中性福爾馬林固定，制作切片，進(jìn)行HE染色，PAS染色并在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察及拍照。

1.8 真菌分離株的藥敏試驗(yàn)將待測菌株菌懸液利用分光光度計(jì)調(diào)整其濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷峁芡腹舛?，約為5×105cfu/mL，再用生理鹽水1:1稀釋。按丹麥Rosco真菌藥敏紙片擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)，取0.5 mL菌液傾注于9 cm平皿，用玻棒將菌液涂布均勻，25℃干燥 10 min后貼藥敏紙片。25℃培養(yǎng)24 h～36 h后測量。抑菌圈直徑≥20 mm的記為敏感；抑菌圈直徑在12 mm～19 mm范圍內(nèi)的記為中介；抑菌圈直徑≤11 mm的記為耐藥。

2 結(jié)果與討論

2.1 患病大熊貓皮膚病的初步診斷在顯微鏡下觀察到大熊貓患處皮屑及毛發(fā)存在菌絲和孢子，結(jié)合患部被毛部分脫落，皮膚層增厚出現(xiàn)肉芽腫，初步診斷該大熊貓患真菌性皮膚病。

2.2 真菌的分離純化及形態(tài)學(xué)特征從皮屑和毛發(fā)樣品中分離到1株真菌(編號為：JYZ030101)。該真菌在25℃，SDA培養(yǎng)基上生長良好，菌落干燥，呈墨綠色霉菌型菌落，邊緣較整齊，除邊緣外均生長墨綠色短毛(圖1A)。顯微特征觀察顯示菌絲呈管狀不規(guī)則分布，可見杯狀產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)以及大小不一的孢子(圖 1B)。

2.3 真菌分離株的分子生物學(xué)鑒定經(jīng)PCR方法擴(kuò)增菌株JYZ030101的ITS區(qū)，獲得617 bp的目的基因片段。序列提交 GenBank(KY283137)。用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的相關(guān)基因序列比對，顯示分離株ITS區(qū)基因序列與C.pluriseptata(JQ766429.1)的ITS基因序列的相似性達(dá) 99%。采用鄰接法經(jīng)過1 000次自展分析得到系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 2)，分離株以 95%的支持率與C.pluriseptata聚在同一分支。表明分離株即為C.pluriseptata。

真菌核糖體RNA(rRNA)基因是串聯(lián)重復(fù)排列的結(jié)構(gòu)，每個重復(fù)結(jié)構(gòu)編碼18S、5.8S和26S基因，在兩個不同的區(qū)域間存在ITS和基因間隔區(qū)[9]。ITS基因具有準(zhǔn)確、快速、引物通用性強(qiáng)、便于高通量測序與分析等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于真菌系統(tǒng)發(fā)育、種間和種內(nèi)遺傳多樣性研究[10]。近年，真菌rDNA ITS區(qū)測序后的BLAST分析已廣泛應(yīng)用于菌種的分子鑒定，相似性超過98%的菌株可認(rèn)定為同一菌種[10]。本實(shí)驗(yàn)使用相鄰接近法構(gòu)建種系發(fā)育樹，結(jié)果顯示分離株JYZ030101與C.pluriseptata聚為同一支，置信度檢測結(jié)果為99%，因此結(jié)合形態(tài)學(xué)與BLAST比對結(jié)果將JYZ030101鑒定為C.pluriseptata。

圖1 C.pluriseptata的形態(tài)特征Fig.1 The morphological characteristics of C.pluriseptata

圖2 C.pluriseptata系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the ITS sequences of C.pluriseptata

2.4 真菌分離株的致病性試驗(yàn)

2.4.1 實(shí)驗(yàn)動物臨床癥狀涂擦注射菌懸液一周后，實(shí)驗(yàn)組小鼠精神食欲較差，被毛雜亂無光。對照組小鼠精神食欲沒有明顯變化。免疫抑制皮下注射組A2組小鼠注射處形成肉芽組織，中央凹陷，出現(xiàn)潰爛結(jié)痂(圖3A)。涂擦組A1、B1小鼠涂擦部位沒有明顯變化，外傷基本痊愈，毛發(fā)開始生長。

2.4.2 剖檢變化A2組小鼠皮下注射部位形成肉芽腫，表皮潰爛結(jié)痂。A3組一只小鼠皮膚肌肉組織蒼白，肝臟顏色變暗。B組無明顯變化。

2.4.3 真菌分離株接種小鼠后的病理組織學(xué)變化實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚主要為感染性肉芽腫，HE染色的病理切片可見肝臟膿腫，充血，小血管擴(kuò)張且界限不明顯、病灶呈現(xiàn)中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞增生、壞死、明顯變形(圖3A、3B)。肌肉壞死(圖3C)。皮膚病變處細(xì)胞壞死，有成纖維細(xì)胞和大量炎性細(xì)胞浸潤，表皮組織消失機(jī)化(圖3D)。PAS染色在感染組織中可見形態(tài)各異的菌絲及圓形或卵圓形真菌孢子(圖3E、3F)。

圖3 小鼠組織病理變化Fig.3 Histopathological changes in the tissues of infected mice

取感染小鼠的病變區(qū)域逆培養(yǎng)真菌，提取DNA用ITS通用引物PCR擴(kuò)增以后進(jìn)行序列比對，結(jié)果表明與分離析(JYZ030101)的相似性為100%。致病性試驗(yàn)結(jié)果表明臨床分離株(JYZ030101)通過不同的感染方式均可引起免疫抑制組小鼠不同程度的感染，而正常組和空白對照組均未見感染，表明該菌為條件致病菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果顯示C.pluriseptata分離株對特比萘芬、氟胞嘧啶、伊曲康唑和兩性霉素B表現(xiàn)為耐藥，對克霉唑和咪康唑表現(xiàn)為中度敏感，對酮康唑、氟康唑和伏立康唑均表現(xiàn)為敏感(表1)。

表1 C.pluriseptata對9種抗真菌藥物敏感性Table 1 The susceptibility of C.pluriseptata to nine antifungal drugs

雖然皮膚癬菌感染和酵母菌感染在淺表皮膚真菌感染病例中占多數(shù)，但暗色真菌感染的報(bào)道也時有出現(xiàn)。有文獻(xiàn)報(bào)道了人體體表分離的杯梗孢屬和瓶霉屬真菌共81株的藥物敏感性試驗(yàn)，其中包括C.pluriseptata[3]。試驗(yàn)顯示氟康唑?qū)υ摼男Ч畈?，特比萘芬效果最好，這兩個結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)有差異。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C.pluriseptata對氟康唑敏感而對特比萘芬耐藥，這可能是因?yàn)榉蛛x菌的來源不同，菌株有一定差異，導(dǎo)致藥敏結(jié)果的差異。另外二者的菌株數(shù)均比較少，普遍性不強(qiáng)。該病例初步診斷為真菌性皮膚病后按照臨床經(jīng)驗(yàn)隨機(jī)使用酮康唑乳膏涂擦患部，連續(xù)2周以后痊愈，在后期的藥敏試驗(yàn)顯示該菌的確也對酮康唑敏感。

臨床上對C.pluriseptata相關(guān)研究十分有限，相關(guān)病例也比較少見，在動物感染試驗(yàn)中，可見其對免疫抑制組小鼠肝臟和真皮層的損害較重。表明該菌對免疫力低下的動物有造成侵襲性感染的可能。所以對該菌進(jìn)行分離鑒定以及藥物敏感性實(shí)驗(yàn)顯得尤為重要。