狐貍源肺炎克雷伯氏菌分離株生物學(xué)特征分析

楊 延，劉 夢，趙麗麗，魏成威，王曉妍，蔣情琴，葛俊偉*，陳洪巖*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069)

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pueumouiae)屬腸桿菌科、克雷伯氏菌屬，是一種重要的人獸共患病病原，目前已經(jīng)成為僅次于大腸桿菌的第二大重要條件致病菌[1]。該菌可以引起肺炎、腦膜炎、肝膿腫、眼內(nèi)炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎，傷口感染和全身敗血癥等，發(fā)病率和死亡率極高。同時該菌的耐藥性不斷增強，且多為多重耐藥，增加了臨床治療的難度。研究表明，人類是克雷伯氏菌感染傳染源之一[2]，人源樣本的檢出率也在逐年上升，對人類的危害日益加劇，已經(jīng)成為醫(yī)院的重要潛在感染菌。長期以來，克雷伯氏菌并未對畜禽造成巨大危害，因此一直未引起足夠重視。但近年來，不斷有肺炎克雷伯氏菌感染動物的報道，目前已在發(fā)病兔、奶牛、豬、牛、雛雞和大熊貓中分離出高致病性的肺炎克雷伯氏菌[3]。

已有報道發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯氏菌可以感染狐貍，引起狐貍上呼吸道黏膜充血、水腫，化膿性胸膜肺炎，母獸空懷、流產(chǎn)、死胎，個別有嘔吐和腹瀉癥狀[1]。但有關(guān)狐貍源肺炎克雷伯氏菌的研究多集中在病理報告和藥敏試驗，有關(guān)其耐藥機制、致病性、生物被膜(Biofilm，BF)形成能力等方面的研究較少。本實驗對從患病死亡的狐貍中分離得到的10株肺炎克雷伯氏菌致病性、耐藥性、耐藥機制、血清型和毒力基因進行分析，為今后研究該菌的致病機制、臨床治療和疾病防控提供了有效的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品及實驗動物10株肺炎克雷伯氏菌(分別命名為：89F-2、58F-2、61N-1、克 1、61N-2、60N-1、克 2、87G-2、87N-2、81P-1)分離自 2015年～2017年期間黑龍江省不同地區(qū)狐貍養(yǎng)殖場送檢至東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院的病死狐貍。經(jīng)溶血酶基因(khe)和16S rRNA基因檢測確認為肺炎克雷伯氏菌菌株。55只6周齡～8周齡清潔級BALB/c小鼠購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑營養(yǎng)瓊脂和革蘭氏染色試劑購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細菌生化微量鑒定管和藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司；細菌基因組提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA Marker、ExTaqDNA聚合酶和pMD19-T Simple試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 細菌分離培養(yǎng)及生化鑒定分離菌接種于血清LB培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和血平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后涂片，進行黏液絲實驗[4]和革蘭氏染色鏡檢。同時依照伯杰氏手冊及相關(guān)文獻對分離株的純培養(yǎng)物進行生化鑒定。挑取優(yōu)勢菌落到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，加甘油凍存。

1.4 分離菌的小鼠致病性試驗將55只小鼠隨機分成11組，每組5只。分別將分離菌株純培養(yǎng)物接種于血清LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16 h，調(diào)整菌液濃度為1×109cfu/mL，小鼠腹腔注射 0.2 mL/只；對照組腹腔注射無菌血清LB培養(yǎng)液0.2 mL/只。觀察2周內(nèi)同一飼養(yǎng)狀態(tài)下所有實驗鼠的臨床癥狀并對死亡小鼠各臟器進行細菌分離培養(yǎng)和鑒定。

1.5 分離菌的藥敏試驗及耐藥基因檢測根據(jù)WHO推薦的K-B紙片擴散法和美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)手冊，以E.coliATCC2592作為質(zhì)控菌株，檢測分離菌株對包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、頭孢菌素類、大環(huán)內(nèi)酯類的21種常用抗菌藥物的敏感性。同時，采用細菌質(zhì)粒小提試劑盒提取分離菌中的質(zhì)粒作為模板。參照文獻[5-9]合成9對引物，分別用于擴增氟苯尼考耐藥基因floR，介導(dǎo)惡唑烷酮類和截短側(cè)耳素類藥物耐藥基因cfr，碳青霉烯類耐藥基因NDM，質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因TEM、SHV、CTX-M、CMY和OXA，分別對分離菌株進行上述耐藥基因檢測。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.6 分離菌莢膜血清型及毒力基因檢測 參照文獻[10-11]，分別合成克雷伯氏菌5種毒力基因和最常見的2種莢膜血清型的引物。5個毒力基因包括：1個為質(zhì)粒介導(dǎo)的毒力基因rmpA(黏液表型基因A的調(diào)控子)和4個染色體介導(dǎo)的毒力基因：wabG(與脂多糖合成有關(guān))、ugE(與莢膜多糖合成相關(guān))、fimH(Ⅰ型菌毛相關(guān)基因)和magA(粘液表型相關(guān)基因)。

1.7 分離菌的BF形成能力檢測參照夏琦琦等[12]的研究方法，采用96孔微量板法，對分離菌株的BF形成能力進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離及形態(tài)特征10株肺炎克雷伯氏菌在血清LB瓊脂培養(yǎng)基上均可形成圓形、濕潤、隆起、灰白色、粘液狀的優(yōu)勢菌落；在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基均形成中等大小、紫黑色帶金屬光澤的菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上形成圓形、濕潤具有擴散現(xiàn)象，粉紅色特征不明顯的中等大小菌落；在血瓊脂平板培養(yǎng)基上所有菌株均不溶血，用細菌接種環(huán)向上挑起菌落，89F-2、58F-2、81P-1挑起黏液絲長度≥5mm，判定為高黏液表型菌；61N-1、克 1、61N-2、60N-1、克 2、87G-2、87N-2挑起黏液絲長度 ＜5mm，判定為非高黏液表型菌[4]。鏡檢結(jié)果表明，10株分離菌株均為革蘭氏陰性，單個、成對或個別短鏈狀排列的粗短桿菌，有莢膜，菌體大小為0.5 μm～0.8 μm×0.6 μm～2.0 μm。

生化鑒定結(jié)果顯示，10株分離菌生化特征一致，均可以發(fā)酵多種糖類，不產(chǎn)生H2S，可分解尿素，利用枸櫞酸鹽等(表1)，與肺炎克雷伯氏菌的生化特征相一致，符合肺炎克雷伯氏菌的生物學(xué)特性。

表1 分離菌株的生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the bacteria isolates

2.2 分離菌的致病性試驗接種分離菌的實驗組小鼠在感染6 h后發(fā)病，開始表現(xiàn)為站立不穩(wěn)、精神沉郁、被毛逆立、腹式呼吸、眼睛緊閉，隨后眼部伴有紅色膿性滲出物和腹瀉等癥狀，采食和飲水明顯減少。接種24 h內(nèi)50只實驗組小鼠死亡47只。接種30 h后，僅存的3只實驗組小鼠逐漸恢復(fù)，分別來自感染 58F-2、61N-2、89F-2菌液的實驗組。對照組小鼠活動正常，未見異常。對死亡小鼠剖檢，腹腔有土黃色膠凍狀渾濁積液且易拉絲，肝、脾腫脹并伴有出血點，胃部脹氣，淋巴結(jié)腫大。對死亡小鼠觸片染色鏡檢，可見大量革蘭氏陰性桿菌。進一步培養(yǎng)鑒定顯示，死亡小鼠組織中分離得到的細菌與接種菌株的培養(yǎng)特性和染色特性一致。表明分離菌對小鼠具有較強的致病性。

2.3 分離菌的藥敏試驗KB擴散法結(jié)果顯示，10株分離菌株大多數(shù)對多黏菌素(90%)、氟苯尼考(80%)和磷霉素(80%)高度敏感；對氨芐西林、青霉素鈉、四環(huán)素、利福平、泰樂菌素、甲氧嘧啶、萬古霉素、氯霉素、頭孢噻呋鈉、鏈霉素的耐藥性較高，50%以上的菌株表現(xiàn)耐藥(表2)。表明分離菌株具有很強的耐藥性，且呈現(xiàn)多重耐藥。

表2 分離株藥敏試驗結(jié)果Table 2 Susceptibility test results of the isolates

2.4 分離菌的耐藥基因檢測結(jié)果從分離菌提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行鑒定結(jié)果顯示，在10株肺炎克雷伯氏菌分離株中，7株菌(81P-1、87G-2、60N-1、克1、克 2、58F-2、89F-2)為 ESBLS陽性，且均檢測到TEM基因，7株菌(81P-1、87G-2、61N-2、克1、克 2、58F-2、89F-2)檢測到floR基因，4株菌(81P-1、87G-2、61N-2、克 1)檢測到mcr-1基因 (圖1)。所有菌株均未檢測到CTX-M、CMY、SHV、OXA、cfr和NDM基因。

2.5 分離菌的莢膜血清型及毒力基因檢測結(jié)果毒力基因檢測結(jié)果顯示，wabG和fimH檢出率最高，為50%(5/10)，其次為uge，檢出率為 40%(4/10)，rmpA檢出率比較低，僅為10%(1/10)，magA未檢出；同時檢測到wabG、uge和fimH的有 4株菌(61N-1、61N-2、克 1、克 2)。血清型測定結(jié)果顯示：89F-2、58F-2、60N-1的血清型為K1型，K2未檢測到，表明分離的肺炎克雷伯氏菌株可能存在K1之外其它血清型，還有待于進一步確定。

圖1 10株分離菌mcr-1基因的PCR結(jié)果Fig.1 Detection of mcr-1 gene in the isolates by PCR

2.6 分離菌的BF形成能力檢測經(jīng)96孔微量板測定，10株肺炎克雷伯氏菌中BF強陽性的有4株(克 1、克 2、87G-2、81P-1)，5 株(58F-2、61N-1、61N-2、60N-1、87N-2)呈現(xiàn)弱陽性，僅有 1株(89F-2)表現(xiàn)陰性，陽性率為90%。表明分離菌株具有較強的BF形成能力。

3 討論

本實驗對2015年～2017年黑龍江省多個養(yǎng)殖場送檢的病死狐貍中分離的10株細菌形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化試驗進行檢測，進一步確認其均為肺炎克雷伯氏菌。動物實驗結(jié)果顯示，分離株具有很強的致病性和致死率。毒力基因測定結(jié)果顯示：wabG、fimH和uge檢出率高(50%、50%、40%)，rmpA檢出率低(10%)，magA未檢出，本研究結(jié)果與楊帆等結(jié)果基本一致[13]。有研究表明fimH為I型菌毛的粘附蛋白，與肺炎克雷伯氏菌粘附上皮細胞相關(guān)；而wabG和uge主要作用為分泌細胞粘附式莢膜多糖，三者均是構(gòu)成肺炎克雷伯氏菌高致病性的主要致病因子。本實驗分離的狐貍源肺炎克雷伯氏菌中，61N-1、克 1、克 2和 61N-2等 4株菌(4/10)同時具有wabG、fimH和uge等 3種毒力基因，這可能是造成狐貍源肺炎克雷伯氏菌表現(xiàn)出強致病和致死率的因素之一。Brisse等的研究表明，幾乎所有的肺炎克雷伯氏菌病的嚴(yán)重感染(肝外感染、血流感染、肝膿腫等)均與莢膜血清型菌株K1或K2相關(guān)，因此對10株肺炎克雷伯氏菌的血清型進行檢測。結(jié)果顯示3株菌檢測到K1基因，K2基因未檢測到。對未能確定莢膜血清型的7株高致死性肺炎克雷伯氏菌，對其莢膜血清型與致死性是否存在相關(guān)性將進行下一步的研究。

耐藥基因檢測結(jié)果顯示，10株狐貍源肺炎克雷伯氏菌中有7株ESBLs為陽性菌，陽性檢出率為70%(7/10)，且均為TEM型，未檢測到SHV、CTX-M、CMY和OXA型。表明本研究中肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)生的ESBLs耐藥基因型以TEM為主，這與刀麗梅等報道的一致[14]。TEM是革蘭氏陰性桿菌中最常見的β-內(nèi)酰胺酶，主要介導(dǎo)細菌對各種青霉素和部分第1代頭孢菌素耐藥。這與藥敏試驗中分離的7株ESBLs肺炎克雷伯氏菌對氨芐西林和青霉素鈉耐藥率為100%的結(jié)果相一致。與此同時，對10株不同來源的狐貍源克雷伯氏菌進行mcr-1基因的檢測，顯示有 4株菌(分別為 81P-1、87G-2、61N-2、克 1)中攜帶mcr-1基因，這一現(xiàn)象在此前有關(guān)狐貍源克雷伯氏菌的研究中還未發(fā)現(xiàn)。值得注意的是，這4株mcr-1基因檢測結(jié)果為陽性的肺炎克雷伯氏菌卻均對多黏菌素敏感。這可能與質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥水平較低，K-B法測定耐藥性所用的藥敏片所含藥量過大使得低水平的耐藥無法顯現(xiàn)。此前的研究表明，mcr-1基因介導(dǎo)的較低水平的黏菌素耐藥，MIC值介于2 mg/L～16 mg/L，相比之前報道的染色體介導(dǎo)的黏菌素耐藥水平低2～4倍[8]。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的機制還需要進一步解析。

自2015年首次在豬肉、雞肉和患者身上發(fā)現(xiàn)多黏菌素耐藥基因mcr-1后[15]，已經(jīng)有35個國家在人類、動物、食物和環(huán)境中檢測到該耐藥基因[8]。在我國，已經(jīng)從雞豬源大腸埃希氏菌[15]、豬源沙門氏菌、貓、犬源大腸埃希氏菌檢測到mcr-1基因，同時在醫(yī)院廢水的肺炎克雷伯氏菌中也檢驗到mcr-1基因的存在。表明質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因可能已經(jīng)通過基因的水平轉(zhuǎn)移至狐貍源克雷伯氏菌。使克雷伯氏菌對多黏菌素的耐藥性更強，危害更大。同時因為該基因可位于多種質(zhì)粒中，極易在細菌間水平傳播，極大提高了多黏菌素耐藥性迅速升高的可能性。因此，必須加強對畜禽的管理和人與動物中mcr-1基因的監(jiān)測，嚴(yán)格規(guī)范這類藥物的使用，防止因大量使用多黏菌素而造成肺炎克雷伯氏菌在畜禽甚至人群的暴發(fā)。對提取的10株分離菌的質(zhì)粒中floR基因進行檢測，結(jié)果顯示共有7株菌(分別為 81P-1、 87G-2、 61N-2、 克 1、 克 2、 58F-2、89F-2)質(zhì)粒中攜帶有floR基因并且這7株菌包括攜帶mcr-1基因的4株菌。這與易靈嫻等研究結(jié)果中顯示的mcr-1陽性菌株常攜帶其它耐藥基因的結(jié)論相一致。同時，在分離的8株對氟苯尼考耐藥的肺炎克雷伯氏菌中，7株含有floR基因，占87.5%，表明floR基因是導(dǎo)致氟苯尼考耐藥的重要原因，其具體作用機制還需進一步研究。

藥敏試驗結(jié)果顯示，分離的肺炎克雷伯氏菌對β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素、氨基糖苷類在內(nèi)的多種常用抗生素具有較強的抗藥性，而且存在嚴(yán)重的多重耐藥現(xiàn)象。這可能與氨芐西林、青霉素鈉、四環(huán)素、利福平等抗生素較為常見并且價格低廉，養(yǎng)殖戶在狐貍養(yǎng)殖過程中對這些藥物的濫用或不合理的使用有關(guān)。磷霉素、慶大霉素、多黏菌素、頭孢哌酮在體外的抑菌效果最好，可以作為臨床治療肺炎克雷伯氏菌病的候選藥物。Munoz-Price等研究表明，多黏菌素B和黏菌素對治療多重耐藥肺炎克雷伯氏菌引起的感染取得良好效果，并且用作飼料添加劑可以起到提高免疫力和促生長的作用，因此對于黏菌素的使用量正逐步增多。導(dǎo)致細菌對黏菌素的耐藥性出現(xiàn)了上升的趨勢，例如，對2006年～2007年韓國研究發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯氏菌對黏菌素的耐藥率為6.8%[16]；2013年上海市某豬場調(diào)查發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中57.4%的菌株對黏菌素表現(xiàn)耐藥[17]。因而在臨床治療細菌性疾病時，也要注意粘菌素使用的劑量和交替使用，避免耐藥菌株的產(chǎn)生。

本研究表明，從狐貍分離的致病性肺炎克雷伯氏菌的一個典型特征就是BF形成陽性率較高，而且均呈強陽性(+++)。從狐貍中分離的致病性肺炎克雷伯氏菌為何具有如此強的BF形成能力，又是否和致病性、耐藥性有關(guān)系還需要進一步解析。