Wnt5a在炎癥微環(huán)境下的牙周膜干細(xì)胞中的作用研究*

李影 劉娜 張維 顧斌

牙周炎是發(fā)生于牙周支持組織的慢性破壞性疾病。全國(guó)第三次流行病調(diào)查結(jié)果顯示80%人口均患有牙周炎[1]。牙周炎的現(xiàn)有治療手段主要是牙周基礎(chǔ)治療配合局部抗炎藥物的使用，并不能夠有效的治愈牙周炎。PDLSCs是從牙根分離出的多向分化能力的干細(xì)胞，可以修復(fù)牙周組織的破壞及損傷，但是在慢性炎癥微環(huán)境下，PDLSCs的成骨分化能力及修復(fù)牙周組織能力減弱。牙周組織破壞的機(jī)制是怎樣的呢？

金巖課題組發(fā)現(xiàn)TNFα通過激動(dòng)Wnt通路來抑制PDLSCs的成骨能力，DKK-1抑制Wnt通路后可部分恢復(fù)PDLSCs的成骨能力。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)通過激活Wnt3a來增加成骨能力[2]。本課題組前期研究表明，在干細(xì)胞增殖及成骨分化過程中經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮關(guān)鍵作用，過表達(dá)β-catenin可增強(qiáng)PDLSCs的增殖能力，抑制PDLSCs的成骨分化能力[3]。后又對(duì)炎癥微環(huán)境下的PDLSCs成骨分化機(jī)制進(jìn)行探究，結(jié)果顯示在慢性炎癥微環(huán)境中非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路參與PDLSCs的成骨分化，Wnt/Ca2+通路中CaMKII、NLK蛋白與干細(xì)胞成骨分化正相關(guān)[4]。徐雅麗等對(duì)門診拔除的25顆慢性根尖周炎患牙研究表明，與對(duì)照組相比，慢性根尖周炎中根尖周病變組織檢測(cè)出Wnt5a量相對(duì)較高。并且表達(dá)的高低與根尖周病變范圍的大小有相關(guān)性。推測(cè)Wnt5a在慢性根尖周炎的發(fā)生、發(fā)展中起著一定作用[5]。那么在慢性牙周炎中，Wnt5a是否也起著一定的作用呢。本研究將探究在慢性炎癥微環(huán)境下，Wnt5a在PDLSCs中的作用及其機(jī)制。

1.材料與方法

1.1 材料 α-MEM培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)(Gibco BRL)；PBS、loading buffer、彩虹 180 廣譜蛋白marker、甘氨酸電泳緩沖液、電泳轉(zhuǎn)移緩沖液、5%BSA封閉液、ECL超敏發(fā)光液(Solarbio)；0.25%胰蛋白酶-EDTA(Sigma,St Louis,MO,美國(guó))；EDTA;青鏈霉素(Gibco BRL)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(Applied Biosystems 7500，美國(guó) Life Technologies公司)；RNA抽提試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)；4%組織細(xì)胞固定液(Solarbio)；RIPA(Invitrogen)；引物(華大基因)；Wnt5a抗體，羊抗兔免疫熒光二抗(Abcam)；丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(AP)、Bis-Tris、十二烷基硫酸鈉鹽(SDS)(Sigma)。

1.2 PDLSCs體外分離培養(yǎng) 從口腔頜面外科門診獲取患者的健康離體牙8顆，分離培養(yǎng)獲得PDLSCs，培養(yǎng)及鑒定遵循本課題組前期實(shí)驗(yàn)步驟[6]。在超凈工作臺(tái)內(nèi)將拔除后的牙齒經(jīng)0.01mol/L PBS沖洗5～7次后，自牙冠至牙根方向單向刮取牙根中下1/3部分的牙周膜，修剪組織塊為1mm3大小，Ⅰ型膠原酶消化15min后，離心管內(nèi)的組織離心800r/min。棄上清后重懸并放置在6孔板中(含15%FBS、100μmol/L抗壞血酸、0.292mg/mL谷氨酰胺、100單位/mL青霉素/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基)。在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)5～8d，直至有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%匯合時(shí)用胰酶/EDTA(0.25/0.1，pH=6.4)消化傳代，標(biāo)記為第一代。采用有限稀釋法克隆化培養(yǎng)分離人正常組織來源的牙周膜干細(xì)胞，取第3～4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 正常及炎癥因子組PDLSCs克隆形成 正常及炎癥因子組PDLSCs消化計(jì)數(shù)，2000個(gè)細(xì)胞懸浮于普通培養(yǎng)液接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿，炎癥因子組用含10ng/ml TNFα的普通培養(yǎng)液持續(xù)刺激，3～4d換液，共培養(yǎng)14d。PBS沖洗兩遍后，4%組織細(xì)胞固定液固定30min，采用吉姆薩染色試劑盒進(jìn)行染色30min，后洗去染色液，拍照。

1.4 qPCR檢測(cè)正常及炎癥因子組PDLSCs炎癥因子基因表達(dá)水平 將PDLSCs消化計(jì)數(shù)，重懸至1×105個(gè)/ml，六孔板每孔加入500ul，補(bǔ)液至2.0ml。待細(xì)胞密度至80%，炎癥因子組加入10ng/ml TNFα的培養(yǎng)液刺激24h，用Trizol分別提取各組RNA，測(cè)濃度后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Sybr Green試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，目的基因及管家基因在不同的反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系均為20μl。引物序列：GAPDH,上游引物:5′-TCTGACGACTCTGCTTCACG-3′,下游引物:5′-TTCAGGGCATGTGTGATGCT-3′；TNFα，上游引物:CACCACTTCGAAACCTGGGA，下游引物:TGTAGGCCCCAGTGAGTTCT;IL-1β，上游引物：ACCAAACCTCTTCGAGGCAC，下游引物:CGAGCTCAGGTACTTCTGCC。反應(yīng)條件：95℃變性20min，95℃30s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀監(jiān)測(cè)記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由軟件自動(dòng)計(jì)算后得出。驗(yàn)證該方法的重復(fù)性和擴(kuò)增效率。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 qPCR檢測(cè)正常及炎癥因子組PDLSCs成骨基因表達(dá)水平 將PDLSCs消化計(jì)數(shù)，重懸至1×105個(gè)/ml，六孔板每孔加入500ul，補(bǔ)液至2.0ml。待細(xì)胞密度達(dá)70%-80%左右時(shí)，換成骨誘導(dǎo)液，3天換液，共誘導(dǎo)7天，后Trizol提取各組RNA,具體操作步驟同前。引物序列：Runx2，上游引物：5′-CCCGTGGCCTTCAAGGT-3′，下游引物： 5′-CGTTACCCGCCATGACAGTA-3′；ALP，上游引物:5′-ATGTCAACCGAAACGCCTCAG-3′，下游引物:5′-ATGGCGGAGTCGAACATGGCA-3′。反應(yīng)條件同前。

1.6 qPCR及Western Blot檢測(cè)正常及炎癥因子組成骨誘導(dǎo)前后PDLSCs Wnt5a基因及蛋白表達(dá)水平 采用qPCR檢測(cè)Wnt5a mRNA表達(dá)，引物序列：上游引物：5′-TGTTGCTTTCCCGCTTTTCG-3′，下游引物：5′-CCTCTCGGCAGAGGATCAAC-3′。具體條件及步驟同前。將正常組及炎癥因子組成骨誘導(dǎo)前后PDLSCs使用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，調(diào)整至相同濃度，制備蛋白樣品。采用Western Blot檢測(cè)Wnt5a的蛋白表達(dá)水平：配置10%的分離膠、6%的濃縮膠，依據(jù)蛋白定量結(jié)果進(jìn)行蛋白上樣，電壓為80V，電泳20min待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓至120V，電泳60min。隨后將凝膠中的蛋白在轉(zhuǎn)移電泳槽(200mA，2h)中轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluorid，PVDF)膜。用5%BSA封閉液對(duì)PVDF膜封2h，PVDF膜封閉一抗Wnt5a(1∶1000)稀釋，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，4℃過夜。次日取出封有一抗的PVDF膜，復(fù)溫1h后TBST洗膜，每次5min，共3次。加入相應(yīng)濃度的二抗，室溫條件下封閉2h。TBST洗脫二抗，每次10min，共3次。漂洗膜后加入ECL超敏試劑盒顯色，蛋白凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；進(jìn)行多組間比較時(shí)，P值進(jìn)行Bonferroni校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 正常組及炎癥因子組PDLSCs克隆形成率正常組及炎癥因子組PDLSCs接種于大皿，培養(yǎng)14d后鏡下觀均有明顯的克隆形成，克隆中心細(xì)胞密集(見圖1)。染色后克隆集落為藍(lán)色(見圖1)，正常組克隆形成率為13.91%，炎癥因子組為14.89%，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 正常組及炎癥因子組PDLSCs接種14d后克隆形成圖片

2.2 正常組及炎癥因子組PDLSCs炎癥因子表達(dá)水平 正常組及炎癥因子組PDLSCs在六孔板接種7d后，提取RNA，并進(jìn)行qPCR檢測(cè)TNFα和IL-1β的mRNA表達(dá)水平。炎癥因子組TNFα mRNA表達(dá)水平是正常組的1.67倍(*P＜0.05)，炎癥因子組IL-1β mRNA表達(dá)水平是正常組的1.46倍(*P＜0.05)。炎癥微環(huán)境下，PDLSCs的炎癥因子表達(dá)水平增加。

圖2 正常組及炎癥因子組PDLSCs炎癥因子表達(dá)水平

2.3 正常組及炎癥因子組PDLSCs成骨基因表達(dá)水平 正常及炎癥因子組PDLSCs接種于六孔板，進(jìn)行14d的成骨誘導(dǎo)后，進(jìn)行ALP染色。正常組成骨能力較炎癥因子組高，成骨誘導(dǎo)后兩組鏡下觀(圖3B)，均可見成鈣結(jié)節(jié)，正常組較炎癥因子組結(jié)節(jié)數(shù)量多，說明炎癥微環(huán)境下PDLSCs成骨能力較正常組降低。qPCR結(jié)果示，常規(guī)培養(yǎng)條件下，炎癥因子組Runx2、ALP mRNA表達(dá)水平與正常組無顯著性差異，成骨誘導(dǎo)后兩組成骨基因表達(dá)水平均上升，正常組分別是炎癥因子組的1.6倍(*P＜ 0.05)、1.447 倍(*P＜ 0.05)。(圖 3C、D)說明在炎癥微環(huán)境的作用下，PDLSCs成骨能力下降。

2.4 正常組及炎癥因子組PDLSCs成骨誘導(dǎo)前后Wnt5a的表達(dá)水平 qPCR結(jié)果顯示，常規(guī)培養(yǎng)條件下，炎癥因子組Wnt5a mRNA表達(dá)水平是正常組1.88倍(*P＜0.05)，成骨誘導(dǎo)后正常組及炎癥因子組Wnt5a mRNA表達(dá)水平分別為常規(guī)培養(yǎng)條件下的 1.27倍(*P＜ 0.05)、1.33倍(*P＜ 0.05)；(圖4A)Western Blot結(jié)果示，炎癥因子組Wnt5a蛋白表達(dá)水平增加，成骨誘導(dǎo)后兩組Wnt5a蛋白表達(dá)水平均增加，炎癥因子組高于正常組。(圖4B)Wnt5a蛋白表達(dá)量灰度分析結(jié)果示，正常組diff、炎癥因子組undiff、炎癥因子組diff分別為正常組undiff的1.2709倍、1.8246倍、2.2176倍。(圖4C)炎癥微環(huán)境下Wnt5a的表達(dá)水平增加，且成骨誘導(dǎo)后Wnt5a的表達(dá)水平也增加，說明Wnt5a可能在PDLSCs炎癥發(fā)生發(fā)展及成骨破骨平衡過程中發(fā)揮重要的作用。

圖3 正常組及炎癥因子組PDLSCs ALP染色大體觀、鏡下觀(×200)及成骨基因表達(dá)水平

圖4 正常及炎癥因子組PDLSCs成骨誘導(dǎo)前后Wnt5a mRNA及蛋白表達(dá)水平

3.討論

干細(xì)胞具有多向分化能力、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程中具有廣闊的應(yīng)用前景。Kawaguchi H等研究發(fā)現(xiàn)在III級(jí)犬類實(shí)驗(yàn)缺陷中，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可以促進(jìn)到20%的牙骨質(zhì)和牙槽骨再生[7]。但臨床應(yīng)用中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取材存在一定的困難。PDLSCs具有干細(xì)胞的共有特性，且取材方便，是組織工程研究的熱點(diǎn)。有研究者采用PDLSCs復(fù)合纖維膜片技術(shù)用于牙再植，取得了較好的臨床效果[8]。慢性炎癥微環(huán)境下，PDLSCs增殖能力增強(qiáng)，但是成骨分化能力較弱，組織修復(fù)能力減弱[3]。Wnt通路分為經(jīng)典通路Wnt通路和非經(jīng)典Wnt/Ca2+通路，Wnt/β-catenin(β-連環(huán)蛋白)經(jīng)典通路與TCF/LEF家族形成復(fù)合體，主要調(diào)控干細(xì)胞增殖[9]。而非經(jīng)典Wnt/Ca2+通路與干細(xì)胞的成骨分化正相關(guān)。X Chen課題組研究表明在炎癥微環(huán)境下NFkB通過與β-catenin的競(jìng)爭(zhēng)來調(diào)節(jié)PDLSCs的成骨分化[10]。

我們的結(jié)果表明，炎癥微環(huán)境下PDLSCs炎癥因子TNFα、IL-1β的表達(dá)水平是增加的。大量研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥牙周組織中存在的大量的促炎性細(xì)胞因子(TNFα、IL-1β等)，參與牙周組織免疫反應(yīng)及破骨細(xì)胞分化，TNFα和IFNγ可通過Fas-FasL途徑調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的組織再生[11]。成骨誘導(dǎo)后兩組成骨基因Runx2、ALP mRNA的表達(dá)水平均增加，但是炎癥因子組較正常組較低，說明慢性炎癥微環(huán)境下，由于炎癥因子的存在干擾了牙周組織的成骨破骨平衡，從而導(dǎo)致牙槽骨的破壞與吸收。Wnt5a是巨噬細(xì)胞分泌的一種新型的炎性介質(zhì)，通過自分泌或者旁分泌的方式參與炎癥反應(yīng)。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的體內(nèi)均檢測(cè)到wnt5a呈高表達(dá)狀態(tài)[12，13]。Blumenthal等發(fā)現(xiàn) Wnt5a 基因在微生物或其組分刺激下表達(dá)持續(xù)上調(diào)，且Wnt5a的表達(dá)上調(diào)需要Toll-樣受體(TLR)及核因子 -κβ(NF-κβ)的活化[14]，表明 Wnt5a 及其受體FZD5共同參與了機(jī)體的抗炎癥反應(yīng)。sFRP5和Wnt5a在牙周健康和疾病中表達(dá)之間的新型互惠關(guān)系，使Wnt5a/sFRP5比例具有作為牙周炎生物標(biāo)志物的可能性。

在牙周炎中Wnt5a扮演怎樣的角色呢？有研究者對(duì)20例慢性牙周炎患者牙齦取材，進(jìn)行qPCR及Western Blot檢測(cè)，結(jié)果示慢性牙周炎患者的炎癥性牙齦組織中Wnt5a的表達(dá)水平顯著高于正常牙齦組織(P＜0.05),附著喪失的程度與牙周炎患者牙齦組織中Wnt5a的表達(dá)呈高度正相關(guān)[15]。2008年P(guān)ereira C等研究表明Wnt5a/CaMKⅡ通路參與了炎癥反應(yīng)，并且提出Wnt5a可能調(diào)控了該通路[16]。

我們的qPCR結(jié)果示，常規(guī)培養(yǎng)條件下，炎癥因子組Wnt5a mRNA表達(dá)水平是正常組1.88倍(*P＜0.05)，成骨誘導(dǎo)后正常組及炎癥因子組Wnt5a mRNA表達(dá)水平分別為常規(guī)培養(yǎng)條件下的1.27倍(*P＜ 0.05)、1.33倍(*P＜ 0.05)；Western Blot結(jié)果示，Wnt5a蛋白表達(dá)量Western Blot結(jié)果灰度分析結(jié)果，正常組diff、炎癥因子組undiff、炎癥因子組diff分別為正常組undiff的1.2709倍、1.8246倍、2.2176倍。炎癥因子組Wnt5a蛋白表達(dá)水平增加，成骨誘導(dǎo)后兩組Wnt5a蛋白表達(dá)水平均增加，炎癥因子組高于正常組。而Wnt5a與破骨細(xì)胞的形成息息相關(guān)，為何在成骨誘導(dǎo)后表達(dá)增加？我們推測(cè)可能是因?yàn)樵诔晒钦T導(dǎo)的條件下，成骨增加，相應(yīng)的破骨也增加。炎癥微環(huán)境下Wnt5a的表達(dá)水平增加，且成骨誘導(dǎo)后Wnt5a的表達(dá)水平也增加，說明Wnt5a可能在PDLSCs炎癥發(fā)生發(fā)展及成骨分化過程中均發(fā)揮重要的作用。有學(xué)者研究結(jié)果表明，活化的NLK可以磷酸化TCF，阻止β-catenin-TCF復(fù)合體與DNA結(jié)合，并且Wnt5a和Rfz-2均可刺激Ca2+釋放并活化CaMKII[17，18]。非經(jīng)典Wnt-5a/Ca2+通路通過激活TAK1-NLK MAPK級(jí)聯(lián)，拮抗典型Wnt/-catenin信號(hào)。Wnt5a作為一個(gè)重要的前炎癥因子，能夠在不同的細(xì)胞類型中產(chǎn)生炎癥效應(yīng)[19-20]。

Wnt5a在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中的作用及具體機(jī)制，我們將進(jìn)行進(jìn)一步探究。