響應(yīng)面優(yōu)化制備馬面魚皮膠原蛋白的預(yù)處理工藝研究

公維潔，卓先勤，杭瑜瑜，王卉，黃寶芬

（海南熱帶海洋學(xué)院，海南三亞572022）

我國魚類資源十分豐富，種類繁多，但是快速發(fā)展的魚類加工業(yè)給我們帶來了大量的廢棄物（魚鱗、魚皮、魚骨、魚內(nèi)臟、魚頭等）。目前，我國水產(chǎn)加工和綜合利用與發(fā)達(dá)國家相比存在較大差距，其水產(chǎn)品加工率為30%，低于發(fā)達(dá)國家的80%[1]。加工過程中的廢棄物，大部分用于生產(chǎn)飼料魚粉，有價(jià)值的成分利用率較低。研究發(fā)現(xiàn)，這些廢棄物中含有豐富的膠原蛋白，尤其是魚皮含量顯著，可高達(dá)80%[2]。因此，魚皮膠原蛋白的研究受到廣大科學(xué)工作者的關(guān)注[3-7]。

魚皮中除了含有豐富的膠原蛋白，還含有脂肪（約1.5%）、雜蛋白（約2%）及色素等雜質(zhì)。這些雜質(zhì)不僅會(huì)影響魚皮中膠原蛋白的提取率，還會(huì)影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)和純度，因此在提取之前需要對(duì)原材料進(jìn)行脫脂除雜蛋白的預(yù)處理，預(yù)處理的效果會(huì)成為膠原蛋白提取的關(guān)鍵[8]。傳統(tǒng)的脫脂方法有：蒸煮法[9]、堿法、有機(jī)溶劑萃取法[8]、酶法[10]、乳化法[11]；除雜蛋白的方法有：鹽溶液浸泡法、堿法[12]。

馬面魚（Navodon septentrionalis）是我國排名第二位的海洋經(jīng)濟(jì)魚類。在馬面魚加工過程中，魚皮會(huì)整張丟棄，造成巨大的資源浪費(fèi)。本研究以馬面魚皮為原料，探索如何去除馬面魚皮中的脂肪和雜蛋白，同時(shí)減少膠原蛋白的損失，以期得到高品質(zhì)的馬面魚皮膠原蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬面魚：市售。

L-羥脯氨酸、牛血清蛋白（生化試劑標(biāo)準(zhǔn)品）、氫氧化鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、液溴（分析純）：山東西亞股份有限公司；正丁醇、異丙醇、無水乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯（分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

721G-可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；SE602F-電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限股份公司；HH-數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬面魚皮預(yù)處理

將新鮮的馬面魚皮洗凈，凍干，剪切成1 cm2碎片，于-20℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)于4℃條件下解凍。

1.3.2 脫脂工藝優(yōu)化

1.3.2.1 脫脂劑篩選

準(zhǔn)確稱取3 g的干燥馬面魚皮6份，分別加入正丁醇、異丙醇、無水乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯150 mL進(jìn)行脫脂處理，于4℃浸泡20 h，分離并揮干魚皮中的溶劑，測(cè)定其脂肪含量，比較脫脂率，篩選出最佳脫脂劑。

1.3.2.2 脫脂單因素試驗(yàn)

1）脫脂劑濃度

在固定料液比為1∶50（g/mL），脫脂溫度為4℃、脫脂時(shí)間20 h的條件下，用異丙醇溶液進(jìn)行魚皮脫脂，分別調(diào)節(jié)異丙醇濃度為5%、10%、15%、20%、25%浸泡魚皮。測(cè)定其脂肪含量，并計(jì)算脫脂率。

2）脫脂時(shí)間

在固定料液比為1∶50（g/mL）、脫脂溫度為4℃、異丙醇濃度為10%的條件下，進(jìn)行魚皮脫脂，分別浸泡魚皮 6、12、18、24、30 h，進(jìn)行脫脂處理。測(cè)定其脂肪含量，并計(jì)算脫脂率。

3）脫脂溫度

在料液比為 1 ∶50（g/mL）、脫脂時(shí)間 20 h、試劑濃度為10%的條件下，進(jìn)行魚皮脫脂，分別調(diào)節(jié)脫脂溫度為 20、25、30、35、40、45 ℃。測(cè)定其脂肪含量，并計(jì)算脫脂率。

4）料液比

在脫脂時(shí)間為20 h、脫脂溫度為4℃、試劑濃度為10%的條件下，進(jìn)行魚皮脫脂，分別調(diào)節(jié)料液比為1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）。測(cè)定其脂肪含量，并計(jì)算脫脂率。

1.3.2.3 脫脂響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

經(jīng)過單因素試驗(yàn)的綜合分析后，根據(jù)Box-Behnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，以異丙醇濃度、脫脂時(shí)間、料液比為考察因素，馬面魚皮脫脂率為響應(yīng)值，優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平表見表1。

表1 脫脂響應(yīng)面因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface on degreasing

1.3.2.4 脫脂率的計(jì)算

樣品中脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定。

脫脂率/%=（1-脫脂后魚皮中脂肪含量/魚皮原料中脂肪含量）×100

1.3.3 除雜蛋白工藝優(yōu)化

1.3.3.1 除雜蛋白試劑篩選

采用福林酚法[13]測(cè)馬面魚皮中雜蛋白的溶出量，根據(jù)Gabor Huszar的羥脯氨酸法[14]得到膠原蛋白的流失率。準(zhǔn)確稱取7份1 g的干燥馬面魚皮，分別用0.5mol/L 的 NaOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、NaCl與 NaOH聯(lián)用，NaCl與NaHCO3聯(lián)用，NaCl與Na2CO3聯(lián)用進(jìn)行除雜蛋白處理，料液比為1∶50（g/mL），于4℃浸泡20 h。測(cè)定雜蛋白的除雜率和膠原蛋白的流失率。

1.3.3.2 除雜蛋白的單因素試驗(yàn)

1）試劑濃度對(duì)馬面魚皮除雜蛋白效果的影響

在固定料液比為1∶50（g/mL）、浸泡溫度為4℃、時(shí)間20 h的條件下，分別配制均為0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L和0.5 mol/L的NaCl與NaOH聯(lián)用溶液進(jìn)行除雜蛋白處理，吸取除雜上清液，測(cè)定其雜蛋白的除雜率和膠原蛋白的流失率。

2）浸泡時(shí)間對(duì)馬面魚皮除雜蛋白效果的影響

在固定料液比為1∶50（g/mL）浸泡溫度為4℃的條件下，用NaCl與NaOH聯(lián)用進(jìn)行馬面魚皮除雜蛋白處理，分別浸泡魚皮 5、10、15 、20、25 h 和 30 h 后，吸取除雜上清液，測(cè)定其雜蛋白的除雜率和膠原蛋白的流失率。

3）料液比對(duì)馬面魚皮除雜蛋白的效果的影響

在固定浸泡溫度為4℃、時(shí)間20 h的條件下，用NaCl與NaOH聯(lián)用溶液進(jìn)行馬面魚皮除雜蛋白處理，分別調(diào)節(jié)料液比為 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20（g/mL）和1∶25（g/mL），吸取除雜上清液，測(cè)定其雜蛋白的除雜率和膠原蛋白的流失率。

1.3.3.3 除雜蛋白響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

經(jīng)過單因素試驗(yàn)的綜合分析后，根據(jù)Box-Behnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，以NaCl與NaOH聯(lián)用濃度、浸泡時(shí)間、料液比為考察因素，馬面魚皮雜蛋白的除雜率為響應(yīng)值，優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平表見表2。

表2 除雜蛋白響應(yīng)面因素與水平表Table 2 Factors and levels of response surface on removing impurity proteins

1.3.3.4 計(jì)算公式

魚皮中雜蛋白的溶出率，按照該公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Y表示魚皮雜蛋白的溶出率，%；c表示上清液蛋白質(zhì)的濃度，μg/mL；V表示上清液蛋白質(zhì)的體積，mL；W表示濕魚皮的質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用excel和origin9.1軟件分析繪圖，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件DesignExpert8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂工藝優(yōu)化

2.1.1 脫脂劑篩選

分別采用異丙醇、正己烷、乙醚、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行脫脂處理，比較不同試劑的脫脂效果見圖1。

圖1 不同試劑的脫脂效果Fig.1 Effect of degreasing agent type on degreasing efficiency

由圖1所示，在同等條件下，異丙醇的脫脂率最高，為53.04%；其他依次是乙酸乙酯、乙醚、正丁醇、正己烷、石油醚，脂肪脫脂率分別為47.16%、43.80%、41.20%、37.58%、28.32%。此外，異丙醇較其它試劑更具安全性，故本試驗(yàn)選用異丙醇為最優(yōu)脫脂劑。

2.1.2 脫脂單因素試驗(yàn)

2.1.2.1 脫脂劑濃度的影響

保持其他條件不變，分別用5%、10%、15%、20%、25%的異丙醇溶液進(jìn)行脫脂處理，脫脂結(jié)果見圖2。

圖2 脫脂劑濃度對(duì)脫脂率的影響Fig.2 Effect of reagent concentration on degreasing efficiency

如圖2所示，脫脂劑濃度對(duì)脫脂率的影響較大，隨著濃度的提高，脫脂率先升高后降低。異丙醇濃度為15%時(shí)，脫脂率達(dá)到最高。故選擇異丙醇濃度5%～15%作為適宜的脫脂濃度范圍。

2.1.2.2 脫脂時(shí)間的影響

保持其他條件不變，用10%的異丙醇分別脫脂6、12、18、24、30 h，脫脂結(jié)果見圖 3。

圖3 脫脂時(shí)間對(duì)脫脂率的影響Fig.3 Effect of treatment time on degreasing efficiency

如圖3所示，隨著脫脂時(shí)間的延長，馬面魚皮的脫脂率不斷提高，當(dāng)脫脂時(shí)間達(dá)到24 h后，脫脂率變化緩慢，可能是因?yàn)殡S著脂肪不斷溶出，溶劑達(dá)到飽和，導(dǎo)致脂肪不再溶出。故選擇18 h～30 h作為最佳的范圍脫脂時(shí)間。

2.1.2.3 脫脂溫度的影響

保持其他條件不變，用10%的異丙醇分別在20、25、30、35、40、45 ℃進(jìn)行脫脂處理，脫脂結(jié)果見圖 4。

圖4 不同脫脂溫度的脫脂效果Fig.4 Effect of temperature on degreasing efficiency

如圖4所示，隨著溫度的升高，馬面魚皮脫脂率逐漸升高，40℃后脫脂率略有降低，考慮到高溫易使膠原蛋白變性，并提高生產(chǎn)成本，故選擇40℃作為最佳的脫脂溫度。

2.1.2.4 料液比的影響

保持其他條件不變，用10%的異丙醇分別在料液比為 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 （g/mL） 進(jìn)行脫脂，脫脂結(jié)果見圖5。

圖5 不同料液比的脫脂效果Fig.5 Effect of solid-to-liquid ratio on degreasing efficiency

如圖5所示，當(dāng)料液比為1∶15（g/mL）時(shí)，脂肪脫脂率最高，達(dá)到78.66%，當(dāng)料液比超過1∶15（g/mL）時(shí)，脫脂率顯著下降。由此可見，適當(dāng)?shù)牧弦罕瓤梢源龠M(jìn)脂肪溶出，過高的料液比反而導(dǎo)致脫脂效果下降，故選擇料液比 1 ∶10（g/mL）～1 ∶20（g/mL）作為最佳的范圍。

2.1.3 脫脂的響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.1.3.1 脫脂的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)值分析

對(duì)馬面魚皮脫脂工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果見表3。利用Desigin-Expert.V8.0.6.1軟件對(duì)表3進(jìn)行了擬合分析，得到了回歸方程方差分析表4，并得到了脫脂響應(yīng)面回歸模型方程為：脫脂率（Y）=+93.91+1.51A+2.71B2.94C-1.89AB-0.23AC+2.83BC-2.91A2-5.16B2-5.42C2。由表4可知，該模型的P＜0.000 1，表明響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平，且相關(guān)系數(shù)：R2=0.977 5，表明試驗(yàn)誤差較小，各因素之間線性關(guān)系顯著，可以用于馬面魚皮的脫脂工藝試驗(yàn)的預(yù)測(cè)。

表3 脫脂的響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The design and results of box-behnken on degreasing

表4 脫脂的回歸方程各項(xiàng)方差分析Table 4 Analysis of variance for regression coefficient on degreasing

方程中一次項(xiàng)B、C對(duì)脫脂率的影響極顯著，A對(duì)其影響顯著。交互項(xiàng)BC對(duì)脫脂率的影響極顯著，AB對(duì)其影響顯著，AC對(duì)其影響不顯著。二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)脫脂率的影響均為極顯著。故各單因素對(duì)馬面魚皮的脫脂影響不是簡單的線性關(guān)系。由表中F值可知，影響脫脂率的因素的主次順序?yàn)椋毫弦罕?脫脂時(shí)間>異丙醇濃度。

2.1.3.2 脫脂響應(yīng)面圖分析

響應(yīng)面圖形能較直觀地反映出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，響應(yīng)面坡度越陡，表明該因素對(duì)響應(yīng)值影響越顯著，等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱。各因素間相互作用對(duì)脫脂魚皮脫脂率的影響見圖6。

圖6 各因素相互作用對(duì)馬面魚皮脫脂率的影響Fig.6 Interaction effect on degreasing efficiency

由圖6可以看出，馬面魚皮的脫脂條件中，料液比對(duì)脫脂效果的影響最為顯著，表現(xiàn)的曲面相對(duì)其他的要陡，脫脂時(shí)間次之，且料液比與脫脂時(shí)間的交互作用最為顯著，表現(xiàn)的等高線圖最為橢圓形，而脫脂時(shí)間與異丙醇濃度的作用效果最小，等高線圖為圓形，這與模型方差的分析結(jié)果相一致。

2.1.3.3 脫脂工藝優(yōu)化后參數(shù)驗(yàn)證

優(yōu)化分析，得到脫脂最優(yōu)工藝為：異丙醇濃度為15%，時(shí)間為 24.96 h，料液比為 1 ∶16.46（g/mL），理論值為92.9%?？紤]到試驗(yàn)操作可行性，將最佳脫脂條件改為：異丙醇濃度15%、脫脂時(shí)間25 h、料液比為1∶15（g/mL），在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的脫脂率分別為：93.14%、92.78%和93.37%，平均脫脂率值為93.10%，與理論值的相對(duì)誤差為0.2%。說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化馬面魚皮的脫脂工藝準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際可操作性。

2.2 除雜蛋白工藝優(yōu)化

2.2.1 除雜蛋白試劑篩選

分別用 0.5 mol/L 的 NaOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、NaCl與 NaOH 聯(lián)用，NaCl與 NaHCO3聯(lián)用，NaCl與Na2CO3聯(lián)用進(jìn)行除雜蛋白處理，比較不同試劑的除雜效果見圖7。

如圖7所示，在同等條件下，0.5 mol/L的NaCl與NaOH聯(lián)用除雜蛋白的效果最佳，除雜率達(dá)到41.54%，同時(shí)膠原蛋白的流失率最低，為0.3%，故選擇NaCl與NaOH聯(lián)用為最佳的除雜蛋白試劑。

圖7 不同試劑的除雜蛋白效果Fig.7 Effect of degreasing agent type on impurity proteins removal rate

2.2.2 除雜蛋白單因素分析

2.2.2.1 試劑濃度的影響

保持其他條件不變，分別配制均為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl與NaOH聯(lián)用溶液進(jìn)行除雜蛋白處理，除雜及膠原蛋白流失結(jié)果見圖8。

圖8 不同試劑濃度的除雜蛋白效果Fig.8 Effect of reagent concentration on impurity proteins removal rate

由圖8可知，當(dāng)NaCl與NaOH聯(lián)用溶液的濃度均為0.3 mol/L時(shí)雜蛋白除雜效果最好，為25.13%，膠原蛋白流失效果相對(duì)較低，故選NaCl與NaOH聯(lián)用溶液濃度均為0.2 mol/L～0.4 mol/L作為最佳的范圍濃度。

2.2.2.2 浸泡時(shí)間

保持其他條件不變，用NaCl與NaOH聯(lián)用進(jìn)行馬面魚皮除雜蛋白處理，分別浸泡魚皮 5、10、15 、20、25、30 h后，除雜及膠原蛋白流失結(jié)果見圖9。

圖9 不同浸泡時(shí)間的除雜蛋白效果Fig.9 Effect of treatment time on impurity proteins removal rate

由圖9可知，浸泡時(shí)間對(duì)膠原蛋白的流失影響較小，當(dāng)NaCl與NaOH聯(lián)用浸泡時(shí)間為25 h時(shí)除雜蛋白效果最好，故選擇的最佳的范圍除雜時(shí)間為20 h～30 h。

2.2.2.3 料液比

保持其他條件不變，用NaCl與NaOH聯(lián)用進(jìn)行馬面魚皮除雜蛋白處理，分別調(diào)節(jié)料液比為1∶5、1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL），除雜及膠原蛋白流失結(jié)果見圖10。

圖10 不同液料比的除雜蛋白效果Fig.10 Effect of solid-to-liquid ratio on impurity proteins removal rate

由圖10可知，隨著液料比的增加，雜蛋白除雜率逐漸增加，膠原蛋白流失率逐漸遞減，當(dāng)液料比增加到20（g/mL）之后，雜蛋白除雜率增加趨勢(shì)緩慢，膠原蛋白流失率遞減的趨勢(shì)也趨于平緩，故選擇液料比15（mL/g）～ 25（mL/g）作為最佳范圍。

2.2.3 除雜蛋白的響應(yīng)面分析

2.2.3.1 除雜蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)值分析

對(duì)馬面魚皮除雜蛋白工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果見表5。

表5 除雜蛋白響應(yīng)面結(jié)果Table 5 The design and results of Box-Behnken on removing impurity proteins

根據(jù)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合分析，得到了回歸方程：雜蛋白除雜率（Y）=30.59+2.36A-0.69B+3.01C-1.36AB-1.30AC+1.50BC-7.80A2-2.24B2-4.40C2。

對(duì)回歸模型的顯著性分析見表6，該模型的P＜0.000 1，表明響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平，且相關(guān)系數(shù)：R2=0.992 0，表明試驗(yàn)誤差較小，各因素之間線性關(guān)系顯著，可以用于馬面魚皮的除雜蛋白工藝試驗(yàn)的預(yù)測(cè)。

表6 除雜蛋白的回歸方程各項(xiàng)方差分析Table 6 Analysis of variance for regression coefficient on removing impurity proteins

方程中一次項(xiàng)A、C對(duì)除雜率的影響均極顯著，B對(duì)除雜率的影響顯著。交互項(xiàng)BC對(duì)除雜率的影響極顯著，AB、AC 對(duì)其影響顯著。二次項(xiàng) A2、B2、C2對(duì)除雜率的影響均極顯著。故各單因素對(duì)馬面魚皮的除雜蛋白影響不是簡單的線性關(guān)系。由表中F值可知，影響除雜率的因素的主次順序?yàn)椋毫弦罕?NaCl與NaOH聯(lián)用濃度>浸泡時(shí)間。

2.2.3.2 除雜蛋白響應(yīng)面圖分析

根據(jù)回歸方程，得到各因素間交互作用對(duì)雜蛋白提取率的影響，見圖11。

如圖11所示，馬面魚皮除雜蛋白的條件中，液料比對(duì)除雜蛋白的效果的影響最為顯著，表現(xiàn)的曲面相對(duì)其他的要陡，NaCl與NaOH聯(lián)用濃度次之，浸泡時(shí)間影響最小。由等高線圖c可以看出，浸泡時(shí)間與液料比的交互作用對(duì)脫脂率的影響最為顯著。

2.2.3.3 除雜蛋白工藝優(yōu)化后參數(shù)驗(yàn)證

根據(jù)軟件分析，得到除雜蛋白最優(yōu)工藝為：NaCl與NaOH聯(lián)用濃度為0.31 mol/L，時(shí)間為24.55 h，料液比為1∶22（g/mL），理論值為31.24%。根據(jù)實(shí)際情況，調(diào)整為NaCl與NaOH聯(lián)用濃度為0.3 mol/L，時(shí)間為25 h，料液比為 1 ∶20（g/mL），在此條件下進(jìn)行 3 次重復(fù)試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的除雜率為31.09%，與理論值基本吻合。說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化馬面魚皮的除雜蛋白工藝準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際可操作性。

圖11 各因素相互作用對(duì)馬面魚皮脫脂率的影響Fig.11 Interaction effect on impurity proteins removal rate

3 結(jié)論

以馬面魚皮為原料，分別對(duì)魚皮中的脂肪和雜蛋白的脫除工藝進(jìn)行了研究。利用溶劑萃取法脫脂，且采用索氏抽提法測(cè)定馬面魚皮中的脂肪含量；利用福林酚法測(cè)定馬面魚皮中的雜蛋白含量。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化得到馬面魚皮脫脂最佳條件為：采用異丙醇溶液為脫脂試劑，濃度15%，料液比為1∶15（g/mL），在 40℃時(shí)處理 25 h，脂率值達(dá)到93.10%；除雜蛋白最佳條件為：采用NaCl與NaOH聯(lián)用溶液進(jìn)行魚皮除雜蛋白處理，濃度均為0.3 mol/L，料液比1∶20（g/mL），處理25 h，不僅能大大的除去雜蛋白，還能降低膠原蛋白的流失率，平均除雜率為31.09%。本試驗(yàn)對(duì)脫脂條件優(yōu)化后，脫脂率較夏姍姍等[15]試驗(yàn)的脫脂率有所提高，為馬面魚皮的深加工提供理論依據(jù)。

（）（）