花青素通過TLR4/NF－κB通路對脂多糖誘導的血管內皮損傷的保護作用

陳 惠，胡 勇

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是多種心腦血管疾病的主要病理基礎，現(xiàn)已嚴重危害到人類的健康［1］。 大量基礎和臨床研究表明［2］，動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，是血管壁對各種損傷的一種異常反應，具有經典炎癥變性、滲出及增生的特點。炎癥反應貫穿動脈粥樣硬化發(fā)病的各個階段，可能是多種致動脈粥樣硬化因素致病機制的共同環(huán)節(jié)或通路。炎癥機制不但與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關，而且與動脈粥樣硬化的多種并發(fā)癥的發(fā)生密切相關。動脈粥樣硬化的炎癥類型包括生物性炎癥、免疫性炎癥和化學性炎癥。動脈粥樣硬化發(fā)病初期主要表現(xiàn)為急性滲出性炎癥，而在進展期主要表現(xiàn)出慢性增生性炎癥的特點。炎癥反應中涉及多種炎癥細胞、炎性細胞因子、炎性介質、黏附分子、趨化因子、生長因子等?，F(xiàn)已證明，多種抗動脈粥樣硬化藥物具有抗炎作用，抗感染治療已成為防治動脈粥樣硬化的一種新途徑。

花青素是一種存在于植物性食物中的具有生物活性的化合物，存在于植物的葉、莖、花和果實中，具有多種藥理作用。研究表明［3］，花青素具有抗氧化、清除自由基、抗炎等作用，花青素其有效成分對內皮細胞有顯著保護作用，從而防止和減輕相關疾病發(fā)生發(fā)展過程中的內皮功能障礙。該研究以脂多糖（LPS）誘導內皮細胞損傷作為模型，研究花青素對血管內皮細胞保護作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 花青素，純度≥98%，購自南京景竹生物科技有限公司。

1.2 細胞 人臍靜脈內皮細胞 （HUVECs），購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 試劑 胎牛血清購自四季青公司、含0.25%EDTA的胰酶和高糖DMEM細胞培養(yǎng)購自美國Hyclone公司；MTT試劑盒購自北京solaibio公司；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒購自南京建成生物公司；一氧化氮（NO）合酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海研謹生物公司；IL-6、TNF-α （ELISA）試 劑 盒 （Beijing Cheng Lin Biological Technology）；二氫乙錠（ DHE，美國 AAT Bioquest公司）；抗體TLR4，NF-κB購自沈陽萬類生物科技公司；HRP標記II抗購自美國Earthox公司；β-actin購自美國SAB公司；ECL化學發(fā)光試劑購自沈陽萬類生物科技公司。

1.4 儀器 TC2323型二氧化碳孵箱 （美國SheldonManufacturing公司），XD-101型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），79-1型磁力加熱攪拌器 （江蘇金壇中大儀器廠），Leica DM1000型熒光顯微鏡（德國Leica公司），BS-124S型電子天平（德國賽多利斯天平有限公司），DNM-9602G型酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司），流式細胞儀（美國伯樂），電泳儀、化學發(fā)光成像儀（Bio-Rad公司）。

1.5 方 法

1.5.1 細胞培養(yǎng)及分組 復蘇HUVECs，培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%抗生素），在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞達到80%左右的融合度時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。實驗分組：空白對照組（只給予培養(yǎng)基）；模型組（培養(yǎng)基中加入1000 ng/ml脂多糖孵育24 h）；花青素組 ［培養(yǎng)基中分別先加入100，50，25（μg/ml）濃度的花青素孵育 12 h，再加入1000 ng/ml脂多糖孵育24 h］。

1.5.2 MTT法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的HUVECs，0.25%胰蛋白酶消化，以 1×105個/ml為接種密度、每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板中。按1.5.1的分組及給藥方法培養(yǎng)后，傾去培養(yǎng)液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液 90 μl，MTT 10 μl（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h；然后棄上清，每孔加入100 μl DMSO，搖床震搖15 min，在酶標儀492 nm波長處測定吸光度值。根據(jù)每組細胞的OD值計算細胞活力。

1.5.3 DHE熒光探針檢測HUVECs中ROS的變化獲取對數(shù)生長期的HUVECs并以1×105個/孔容量接種于6孔板中。分組及給藥同1.5.1，作用24 h后，棄去上清，用PBS洗3次，加入10 μmol/L的DHE，37℃孵育30 min，在熒光顯微鏡下觀察。使用Imge-pro plus 6軟件進一步分析生產結果。結果以相對熒光強度的單位表示。

1.5.4 ELISA法檢測一氧化氮（NO）、TNF-α和IL-6的含量 收集各組細胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測細胞上清液一氧化氮（NO）、TNF-α和IL-6的含量，將試劑盒置于室溫平衡30 min，按照ELISA試劑盒說明進行操作，完畢后全自動酶標儀在450 nm讀取A，繪制標準曲線，根據(jù)各標本A算出相應的濃度。

1.5.5 HUVECs抗氧化指標測定 收集各組細胞培養(yǎng)液上清，利用比色法按照試劑盒說明方法分別檢測各組細胞中LDH、MDA、SOD、GSH-PX含量變化。

1.5.6 免疫印跡法測定蛋白表達 按照實驗設計處理完各組細胞后，棄去上清，收集各組細胞，加入200 μl蛋白裂解液（含 1%PMSF），冰上反復吹打，4℃，12 000 g離心15 min，取上清，通過BCA法進行蛋白定量。制備12%分離膠，5%濃縮膠，SDSPAGE電泳，上樣量為40 μg/20 μl。半干轉轉移至PVDF膜上。3%BSA 室溫封閉 1.5 h。TLR4，NF-κB一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜 3 遍，辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5000）室溫孵育1.5 h，再次TBST洗膜3遍，ECL化學發(fā)光顯影拍照，凝膠成像儀檢測。

1.5.7 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17．0進行統(tǒng)計分析，計量資料采用（±s）表示。在方差齊性條件下多組間比較采用單因（One-wayANOVA）分析，多組間的兩兩比較采用t檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 花青素對脂多糖（LPS）作用后HUVECs活力的影響 MTT檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型組（脂多糖損傷組）活力顯著降低（P＜0．01）；與模型組（脂多糖損傷組）相比，花青素組細胞活力隨濃度梯度增高逐漸上升（P＜0．01）。花青素濃度從 100 μg/ml至150 μmol/L對細胞活力無明顯影響。實驗結果說明花青素可以增強HUVECs的活力（表1）。

表1 花青素對細胞活力的影響（n=5，±s）

表1 花青素對細胞活力的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0．05，#P＜0．01。

分組 細胞活力（%）空白組（對照組）99．5±5．6#脂多糖損傷組（模型組）51．3±3．1花青素組（25 μg/ml）63．4±3．8＊花青素組（50 μg/ml）76．9±4．6#花青素組（100 μg/ml）88．5±5．1#花青素組（150 μg/ml）88．2±5．2

2.2 花青素對脂多糖（LPS）作用后HUVECs ROS的影響 DHE熒光探針檢測顯示，模型組（脂多糖損傷組）HUVECs產生大量ROS，明顯高于空白對照組（P＜0．01）。 而花青素組 ROS 含量逐漸降低（P＜0．01）。實驗表明，花青素可以在脂多糖（LPS）作用后減少HUVECs中ROS的產生（表2）。

2.3 花青素對脂多糖（LPS）作用后HUVECs功能因子和炎性因子的影響 ELISA方法檢測花青素對脂多糖（LPS）作用后HUVECs培養(yǎng)上清液中NO、TNF－α和IL－6含量變化（表3）。檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組 （脂多糖損傷組）HUVECs上清中NO含量顯著下降，TNF－α和IL－6含量顯著上升（P＜0．01）；而不同濃度花青素組細胞上清液中NO含量隨濃度梯度逐漸上升，TNF－α和IL－6含量逐漸下降，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性保護作用（P＜0．01）。

表2 花青素對細胞ROS的影響（n=5，±s）

表2 花青素對細胞ROS的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0．05，#P＜0．01。

分組 ROS（MFI）空白組（對照組）52．6±6．7#脂多糖損傷組（模型組）223．8±29．4花青素組（25 μg/ml）165．3±24．1＊花青素組（50 μg/ml）101．5±13．4#花青素組（100 μg/ml）74．7±5．8#

表3 花青素對細胞功能因子和炎性因子的影響（n=5，±s）

表3 花青素對細胞功能因子和炎性因子的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0．05，#P＜0．01。

分組 NO（μmol/L） TNF－α（pg/ml） IL－6（pg/ml）空白組（對照組）87．5±8．3# 143．4±22．3# 53．5±13．7#脂多糖損傷組（模型組）35．3±14．6 377．9±25．4 164．1±23．2花青素組（25 μg/ml）51．7±13．2＊ 338．6±31．5＊ 143．7±20．5＊花青素組（50 μg/ml）62．3±7．1# 272．8±37．1# 104．3±16．1#花青素組（100 μg/ml）75．2±12．1# 196．1±19．8# 71．2±9．7#

2.4 花青素對脂多糖 （LPS）作用后HUVECs LDH、MDA、SOD和GSH-PX的影響 經檢測發(fā)現(xiàn)（表4），與空白對照組相比，脂多糖損傷組LDH、MDA含量顯著增加，SOD、GSH－PX活性顯著下降（P＜0．01）；當不同濃度花青素作用于脂多糖氧化損傷后的HUVECs時，各組LDH、MDA含量逐漸下降，SOD、GSH－PX 活性逐漸上升（P＜0．01）。

2.5 花青素對脂多糖（LPS）作用后TLR4，NF-κB蛋白表達的影響 Western blot分析顯示，模型組HUVECs細胞中 TLR4，NF－κB蛋白的表達明顯高于空白對照組，而不同濃度的花青素組中以上2種蛋白表達逐漸降低（P＜0．01，表 5）。 因此，花青素對內皮細胞保護作用與TLR4/NF－κB通路密切相關。

3 討 論

脂多糖是革蘭陰性桿菌細胞壁的主要成分，通過脂多糖結合蛋白（LBP）運送后，與各類細胞質膜上的CD14結合，CD14與LPS-LBP復合體結合后，通過Toll樣受體4（TLR4）激活NF-κB信號通路。信號級聯(lián)反應致使炎癥細胞因子如IL-6和TNF-α的釋放［4］。

表4 花青素對細胞LDH、MDA、SOD和GSH-PX的影響（n=5，±s）

表4 花青素對細胞LDH、MDA、SOD和GSH-PX的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0．05，#P＜0．01。

分組 LDH（U/L）MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）GSH－PX（U/mg）空白組（對照組）233．5±44．7# 2．14±0．23# 35．8±2．7# 126．8±18．4#脂多糖損傷組（模型組）914．6±123．9 4．43±0．29 14．3±1．6 60．7±13．1花青素組（25 μg/ml）731．8±145．1＊ 3．65±0．48＊ 19．8±3．1＊ 82．4±16．7＊花青素組（50 μg/ml）583．2±162．3# 2．82±0．22# 24．7±4．5# 104．9±13．9#花青素組（100 μg/ml）314．5±208．5# 2．41±0．25# 30．4±1．9# 60．4±14．6#

表5 花青素對細胞TLR4，NF-κB蛋白表達的影響（n=5，±s）

表5 花青素對細胞TLR4，NF-κB蛋白表達的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0.05，#P＜0.01。

分組 TLR4/β-actin NF-κB/β-actin空白組（對照組）0.23±0.12# 0.32±0.19#脂多糖損傷組（模型組）1.01±0.17 1.14±0.25花青素組（25 μg/ml）0.78±0.19＊ 0.79±0.32＊花青素組（50 μg/ml）0.56±0.14# 0.61±0.13#花青素組（100 μg/ml）0.39±0.11# 0.45±0.16#

炎癥部位的血管內皮細胞既是炎癥過程的參與者，也是炎癥過程的調節(jié)者［5］。長期或者反復的暴露于心血管危險因素，將會導致內源性抗炎系統(tǒng)內皮細胞的損傷。最終內皮不僅喪失功能，而且也會失去其完整性，進一步的衰老而脫落至循環(huán)系統(tǒng)。因此，修復損傷的內皮細胞，對改善血管的功能起著至關重要的作用［6］。

ROS 是指 O－2、脂多糖（LPS）等活性氧簇，大量ROS能夠促進氧化應激誘導內皮細胞損傷及凋亡［7］。該實驗中，脂多糖（LPS）能夠誘導HUVECs產生過量ROS，直接影響細胞存活和功能；而花青素組能明顯降低ROS的產生發(fā)揮保護內皮細胞作用。許多實驗研究和臨床研究表明，氧化應激與動脈粥樣硬化高危因素（如高血壓，高脂血癥，糖尿病，吸煙等）引起的內皮細胞異常密切相關［8］。 LDH，MDA，SOD和GSH-PX可以反映HUVECs的抗氧化能力。氧化損傷后細胞膜的完整性可以通過LDH釋放量來反映。同時，作為脂質過氧化的最終產物，MDA可以反映人體氧自由基的代謝和自由基攻擊細胞的損傷程度。該實驗中，模型組LDH和MDA升高，而不同濃度的花青素組LDH和MDA含量逐漸下降。證明花青素可以維持HUVECs細胞的完整性，減少氧化損傷。SOD和GSH-PX作為抗氧化酶能夠拮抗氧化應激引起的細胞損傷，修復受損細胞，其活性可以反映機體的抗氧化能力。該實驗中，模型組SOD和GSH-PX活性下降，而花青素組HUVECs的SOD和GSH-PX活性顯著增加，說明花青素有助于恢復模型組的抗氧化能力血管內皮細胞。該實驗中，模型組HUVECs活力明顯下降，而花青素組能明顯提升了HUVECs活力。炎癥因子IL-6，TNF-α在動脈粥樣硬化起始環(huán)節(jié)起著重要作用［1，9］，該實驗中模型組IL-6，TNF-α含量明顯上升，而花青素組明顯降低了IL-6，TNF-α含量，說明花青素具有明顯抗炎作用而發(fā)揮對內皮細胞的保護。NO是血管內皮細胞釋放的重要舒血管物質，能夠直接反映內皮細胞分泌功能的強弱［10］。該實驗中模型組NO含量明顯下降，提示內皮細胞分泌功能減弱，而花青素組明顯增加了NO含量，提示花青素恢復了脂多糖（LPS）損傷HUVEC正常分泌功能。

綜上所述，脂多糖（LPS）可導致HUVECs損傷，而花青素對內皮細胞具有直接保護作用，減少ROS導致的氧化應激和炎癥反應，恢復HUVECs正常分泌功能，且部分可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮作用。深入研究內皮細胞炎癥與動脈粥樣硬化病理過程的關系及其具體分子機制，將有助于理解和完善動脈粥樣硬化的發(fā)病機制，將內皮細胞炎癥作為治療靶點，干預炎癥的信號途徑，為研發(fā)新藥物和基因治療提供理論基礎。