紅曲霉合生元對松遼黑豬血清指標(biāo)及背最長肌中MSTN、MyoD基因mRNA相對表達(dá)量影響

高 凱， 張 敏 張宗偉， 李 娜， 張樹敏

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 吉林 延吉 133002； 2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院，吉林 公主嶺 136100)

隨著生活質(zhì)量的提高，人們對瘦肉的需求逐步增加，促使豬的養(yǎng)殖朝高瘦肉率的方向發(fā)展。目前，主要通過培育新品種或改善飼養(yǎng)方式的方法來提高豬的瘦肉率。飼料添加劑作為改善飼養(yǎng)方式的一種，得到了畜牧工作者的廣泛認(rèn)可，但是，帶有抗生素和瘦肉精的飼料添加劑所帶來的危害，又給豬肉的消費帶來了負(fù)面影響，因此，無抗飼料添加劑的研發(fā)勢在必行。而微生態(tài)生物制劑—紅曲霉合生元的出現(xiàn)，在一定程度上可以同時提高畜禽產(chǎn)品的數(shù)量與質(zhì)量。紅曲米和中藥混合發(fā)酵后稱為紅曲酶合生元。其中，紅曲霉發(fā)酵物具有降低血清膽固醇[1-2]、抗氧化[3-4]、增強免疫力、抗應(yīng)激[5]的療效，也具有機體組織著色、食品保質(zhì)[6]、預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病等功能，添加到畜禽飼糧中具有增強生產(chǎn)性能，提高畜禽產(chǎn)品質(zhì)量的功效[7]。而紅棗、山楂和神曲按照一定比例配伍，具有健脾開胃的功效，中藥纖維可以刺激胃腸道蠕動，促進(jìn)腸道有益菌形成優(yōu)勢菌群，維護(hù)腸道健康[8-9]，促進(jìn)動物機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。課題組前期研究證實，該合生元可以提高斷奶仔豬及育肥豬的生長性能[10-12]，也證實合生元可以改善蛋雞血液指標(biāo)[13]，鑒于此，本試驗以飼喂育肥期松遼黑豬添加不同濃度紅曲酶合生元的飼糧，研究其對育肥期松遼黑豬日增重、瘦肉率、血清蛋白、血清轉(zhuǎn)氨酶活性和血脂指標(biāo)的影響，探究其對背最長肌中MSTN、MyoD基因mRNA相對表達(dá)量的影響，探討其對提高瘦肉率是否有效，為紅曲酶合生元的后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅曲霉合生元制作：將飼料級大米與飼料級紅棗、山藥、神曲、山楂一起蒸熟，放在高壓滅菌鍋中(121 ℃、20 min)，滅菌后接種紅曲霉(中國菌種保藏中心，菌種編號：5004；10代改良的耐藥性菌株)，發(fā)酵14 d后，于烘干箱(45 ℃、72 h)中烘干，粉碎成80目，按比例添加到育肥豬飼糧中。經(jīng)檢測，樣品中淀粉酶活力248 U/g,紅曲色素含量為2.0 mg/g，Monacolink含量為2.2 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

采用單因素試驗設(shè)計，選60頭初始體重為(70.00±2.16) kg的松遼黑豬，隨機分為3組，每組5次重復(fù)，每重復(fù)4頭(公母各半)。對照組飼喂不添加紅曲霉合生元的基礎(chǔ)飼糧，其參照中國農(nóng)業(yè)部頒布的豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 65-2004)配制的粉狀配合飼料，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。表1中：1) 預(yù)混料為每千克飼糧提供VA 4 400 000 IU，VD31 500 000 IU，VE16 000 IU，VK3800 mg，VB1700 mg，VB22 400 mg，VB61 200 mg，VB128.4 mg，煙酸145 000 mg，泛酸5 800 mg，葉酸400 mg，生物素70 mg，氯化膽堿75 g，F(xiàn)e 26 g，Cu 40 g，Zn 160 ，Mn 7.6 g，I 100 mg，Se 125 mg;2) 粗蛋白質(zhì)、鈣和總磷為實測值，其余為計算值。

試驗A、B組飼喂的基礎(chǔ)飼糧中紅曲霉中藥合生元添加比例分別為0.5%、1.0%。預(yù)飼期7 d，試驗期60 d，共67 d 。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平 (風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗豬自由采食(粉料，每日飼喂3次)，自由飲用清潔水。定期清理圈舍內(nèi)糞便，保證豬舍地面潔凈、空氣清新，定期巡視豬的生活狀況，免疫程序與豬場一致。采集血樣前，保證12 h空腹?fàn)顟B(tài)。

2 樣品的采集與分析方法

2.1 樣品采集

在飼養(yǎng)試驗結(jié)束時，每重復(fù)隨機選取2頭育肥豬，用規(guī)格10 mL的采血針進(jìn)行前腔靜脈采血，注入普通采血管中。靜止30 min后，放入離心機(3 500 r/min、15 min)，抽取分離血清，保存在 -20 ℃條件下，以備各項指標(biāo)的檢測。育肥豬屠宰后，每頭取背最長肌200 g，放入液氮中速凍2 h，放至-80 ℃冰箱保存，備用。

2.2 血清相關(guān)指標(biāo)檢測

總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷酰轉(zhuǎn)氨酶(GT)、堿性磷酸酶(ALP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)均采用試劑盒檢測，購自南京建成生物工程研究所。球蛋白(GLO)=TP-ALB。

2.3 半定量RT-PCR法分析MSTN、MyoD基因mRNA 相對表達(dá)量

參照與Genbank中登錄號為NM_214435的MSTN基因序列、登錄號為SSU12574的MyoD基因序列和β-actin 基因序列，利用生物軟件primer 5.0和oligo 7.0結(jié)合設(shè)計引物(表2)，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

取背最長肌組織樣品100 mg放入研缽內(nèi)，加液氮迅速研磨至粉糊狀，采用Trizol法提取總RNA樣品，再檢測其濃度和OD值( D260nm/ D280nm=1.8～ 2.0)。取樣本cDNA 1 μL進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)，用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行凝膠電泳檢查電泳產(chǎn)物的PCR擴增情況。同時將PCR擴增產(chǎn)物的凝膠純化，得到PCR擴增產(chǎn)物的膠體溶解后的回收液。電泳后，割膠并用pGEM-T easy Vector systemⅠ試劑盒將回收純化的PCR產(chǎn)物與T-vector載體連接(冰塊上操作)。低溫(4℃)培養(yǎng)18 h后，同時取4 μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA、培養(yǎng)物分別倒進(jìn)200 μL感受態(tài)細(xì)胞(CaCl2法培養(yǎng))中，進(jìn)行目的DNA的轉(zhuǎn)化。

2.4 平均日增重和瘦肉率

平均日增重(ADG)=(育肥豬末重-育肥豬初始重)/試驗期;

瘦肉率(lean percentage；LP)=瘦肉重/(瘦肉重+脂肪重+皮重+骨重)×100%。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用凝膠電泳自帶分析軟件對MSTN、MSTN基因電泳條帶相對于β-actin基因的IOD(Integrated Optical Density)值進(jìn)行半定量分析并記錄數(shù)據(jù)。用Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)，并采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，考察不同水平紅曲酶合生元對松遼黑豬相關(guān)血清指標(biāo)及背最長肌中MSTN、MyoD基因mRNA相對表達(dá)量是否有影響，同時采用LSD法進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同水平紅曲酶合生元對松遼黑豬血清蛋白指標(biāo)的影響

由表3可以看出，與對照組相比，A組與B組的血清TP含量分別提高了4.54%(P<0.05)和4.74%(P<0.05)，血清GLO含量分別提高了23.95%(P<0.05)和24.29%(P<0.05)；但A組與B組之間沒有顯著性差異(P>0.05)。各組間血清ALB含量無顯著性差異(P>0.05)。

表3 不同水平紅曲酶合生元對松遼黑豬血清蛋白指標(biāo)的影響Table 3 Effect of different levels of Monascus symbiotic on serum protein indices in Songliao Black Pigs (g/L)

注:同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

3.2 不同水平紅曲酶合生元對松遼黑豬血清酶活性指標(biāo)的影響

由表4可知，與對照組相比，A組和B組的血清GPT分別下降了1.49%(P<0.05)和1.42%(P<0.05)，但A組與B組之間無顯著性差異(P>0.05)。各組間血清AST、GT、ALP均無顯著性差異(P>0.05)。

表4不同水平紅曲酶合生元對松遼黑豬血清酶活性指標(biāo)的影響

Table4EffectofdifferentlevelsofMonascussymbioticonserumenzymeactivitiesinSongliaoBlackPigs(U/L)

項目對照組A組B組谷丙轉(zhuǎn)氨酶GPT31.60±6.67a31.13±5.83b31.15±4.83b谷草轉(zhuǎn)氨酶AST62.33±14.3862.25±9.8762.35±8.89谷酰轉(zhuǎn)氨酶GT339.10±130.11339.67±126.12340.27±123.54堿性磷酸酶ALP363.93±121.71364.55±109.34362.45±101.14

3.3 不同水平紅曲酶合生元對松遼黑豬血脂指標(biāo)的影響

由表5可知，關(guān)于血清TG含量，A組比對照組降低了3.85%，但差異不顯著(P>0.05)，B組比對照組降低了11.54%(P<0.05)、比A組降低了8.00%(P<0.05)。關(guān)于血清TC含量，A組和B組分別比對照組降低了30.89%(P<0.01)和31.81%(P<0.01),且B組比A組降低了1.32%(P<0.05)。各組間血清HDL、LDL含量均無顯著性差異(P>0.05)。

表5 不同水平紅曲酶合生元對松遼黑豬血脂指標(biāo)的影響Table 5 Effect of different levels of Monascus symbiotic on blood lipids in Songliao Black Pigs (mmol/L)

3.4 各組松遼黑豬背最長肌中MSTN、MyoD基因cDNA質(zhì)量檢測

逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，MSTN和MyoD RT-PCR產(chǎn)物分別經(jīng)1%瓊脂糖電泳，顯示擴增分別得到大小約為282和271 bp左右的片段，與設(shè)計的產(chǎn)物大小很相近，對比分析發(fā)現(xiàn)：同源性分別為97.5%和97.8%。將其中與目的基因相近的條帶割膠回收后電泳，顯示出清晰的目的DNA條帶(圖1，2)。

M：DNA marker P：PCR產(chǎn)物

M：DNA marker P：PCR產(chǎn)物

3.5 各組松遼黑豬背最長肌中MSTN、MyoD基因RT-PCR檢測

根據(jù)半定量RT-PCR方法對不同合生元添加量的松遼黑豬背最長肌中MSTN、MyoD基因的表達(dá)進(jìn)行PCR擴增及電泳檢測，檢測結(jié)果如圖3，4所示。

圖3 不同紅曲酶合生元松遼黑豬背 最長肌中MSTN基因電泳圖譜

圖4 不同紅曲酶合生元松遼黑豬背最長肌 中MyoD基因電泳圖譜

在相同電泳條件下，與對照組相比，試驗A組、B組MSTN基因條帶偏灰暗、MyoD基因條帶偏明亮；表明試驗A組、B組松遼黑豬背最長肌中MSTN基因表達(dá)量少于對照組、MyoD基因表達(dá)量多于對照組。

3.6 不同水平紅曲酶合生元對松遼黑豬背最長肌中MSTN、MyoD基因mRNA相對表達(dá)量的影響

由表6可知，與對照組相比，A組和B組MSTN基因mRNA相對表達(dá)量分別降低了8.46%(P<0.05)和9.23%(P<0.05)；MyoD基因mRNA 相對表達(dá)量分別提高了12.22%(P<0.05)和17.78%(P<0.05)；以上指標(biāo)，A組與B組之間均無顯著性差異(P>0.05)。

表6 MSTN、MyoD基因相對表達(dá)量Table 6 Relative expression of MSTN and MyoD genes

3.7 不同水平紅曲酶合生元對松遼黑豬日增重和瘦肉率的影響

由表7可知，與對照組相比， ADG分別提高了19.76%(P<0.05)和26.85%(P<0.05)；LP分別提高了4.02%(P<0.05)和5.76%(P<0.05)；以上指標(biāo)，A組與B組之間均無顯著性差異(P>0.05)。

表7 不同水平紅曲酶合生元對松遼黑豬日增重和瘦肉率的影響Table 7 Effects of different levels of Monascus symbiotic on the daily gain and lean meat percentage of Songliao Black Pigs

4 討論

4.1 不同水平紅曲酶合生元對松遼黑豬血清指標(biāo)的影響

瘦肉率的提高與育肥豬的營養(yǎng)代謝能力及肝臟健康水平密切相關(guān)。合生元中的次級代謝產(chǎn)物MonacolinK是降血脂的有效成分，且有研究表明紅曲相關(guān)制品比純的MonacolinK效果更為顯著[14-15]。合生元中的神曲可以消除積食，提高育肥豬的采食量，促進(jìn)氨基酸的消化吸收，促進(jìn)血清蛋白升高；山楂含有牡荊素、葉黃酮類化合物、槲皮素、山楂酸等8種具有降血脂功效的物質(zhì)[16-17]，同時山楂果皮、果肉多酚和種子具有消炎、護(hù)肝的功效[18-19]。大棗中多糖、多酚類物質(zhì)可以清理血清TC，提高血清TP含量 ，保護(hù)肝臟[20]。血清TP代表育肥豬體內(nèi)氨基酸代謝、吸收狀況，正常范圍內(nèi)，含量越高，體內(nèi)蛋白質(zhì)沉積越好。在育肥豬飼糧中添加紅曲酶中藥合生元，豬體內(nèi)血清總TP與GLO含量顯著性升高，表明該合生元可以增強機體蛋白質(zhì)代謝能力，促進(jìn)氨基酸的吸收利用，同時也提高了免疫力。這與齊雪[11]的研究紅曲酶中藥合生素可以提高斷奶仔豬生長和免疫性能相一致。

肝臟細(xì)胞損傷后，胞內(nèi)酶(AST、GPT等)大量釋放到血液中，因此血清GPT、AST、GT、ALP含量是診斷肝功能的重要指標(biāo)，在正常范圍內(nèi)，活性降低表示育肥豬利用蛋白的能力升高，有利于維護(hù)肝臟的正常功能。飼喂添加紅曲酶合生元的育肥豬血清GPT顯著降低，血清AST、GT、ALP水平無顯著影響，表明該合生元不僅不會對育肥豬肝臟產(chǎn)生危害，而且具有改善肝臟功能的作用，這與鄭博文等[13]的研究結(jié)果相似。

血清TG、TC、HDL和LDL含量是育肥豬體內(nèi)膽固醇代謝的重要指標(biāo)。飼喂添加量為1.0%紅曲酶中藥合生元的育肥豬血清TG水平明顯低于對照組與0.5%組；飼糧中添加該合生元的育肥豬血清TC含量均極顯著低于對照組，且添加量為1.0%的組顯著低于添加量為0.5%的組，表明飼糧中添加該合生元，有利于降低育肥豬血脂水平，且添加量愈多，效果愈顯著，這與鄭博文等[13]得出的紅曲酶中藥合生元可以顯著提高蛋雞血清HDL、LDL含量略有不同。本試驗中與轉(zhuǎn)運膽固醇相關(guān)的血清HDL、LDL含量有下降趨勢，可能是由于添加合生元的育肥豬長期保持低膽固醇狀態(tài)，機體內(nèi)合成HDL、LDL的量降低，具體機理需進(jìn)一步研究。試驗數(shù)據(jù)表明，合生元的添加可以改善育肥豬的血液指標(biāo)，提高其對氮的代謝和沉積能力。

4.2 不同水平紅曲酶合生元對松遼黑豬背最長肌中MSTN、MyoD基因相對表達(dá)量及肌肉沉降質(zhì)量的影響

育肥豬的生長速度和瘦肉率與肌細(xì)胞生長和肌纖維數(shù)目密切相關(guān)。肌肉的生長發(fā)育是由大量生肌調(diào)控因子共同協(xié)同作用。MSTN基因(肌肉抑制素)屬于TGFβ(transforming growth factor beta)超家族的成員[21]。1999年，Stratil等克隆出豬的MSTN基因[22]。研究發(fā)現(xiàn)，除了通過Smad蛋白家族介導(dǎo)的信號傳遞外，MSTN還可以通過其他的信號通路調(diào)控下游蛋白的轉(zhuǎn)錄。MSTN可以通過激活體內(nèi)的p38信號通路(借助TAK1-MKK6信號級聯(lián)放大反應(yīng))和TAKI/Ras信號通路，調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖與分化[23-24]?？傮w而言，MSTN基因在各物種中，都對骨骼肌的生成有顯著的負(fù)調(diào)控作用；對動物脂肪細(xì)胞的生成有正調(diào)控作用[25]。在胚胎發(fā)育初期， MyoD基因家族的4個基因最先調(diào)控肌肉的分化發(fā)育[26]。家族中的Myf5和MyoD基因最為關(guān)鍵，Myf5首先參與肌細(xì)胞增殖，隨后MyoD開始表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期的退出和細(xì)胞分化的開啟[27-28]。當(dāng)細(xì)胞增殖完成時，MyoD基因啟動分化基因MyoG表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞全面分化。ADG與LP代表育肥豬的肌肉生長能力和總體肌肉沉降質(zhì)量。本試驗數(shù)據(jù)表明：育肥豬飼糧中添加紅曲酶合生元，可以顯著降低MSTN基因mRNA相對表達(dá)量，升高M(jìn)yoD基因mRNA相對表達(dá)量，進(jìn)而促進(jìn)育肥豬體內(nèi)肌細(xì)胞的增殖、分化，減緩脂肪細(xì)胞的生成，顯著提高了育肥豬ADG和LP，且隨著紅曲霉合生元添加量的增加，效果更明顯。這與齊雪[11]、張宗偉等[12]研究結(jié)果相一致。但紅曲霉合生元對脂肪細(xì)胞影響的具體機制尚不清楚，仍需后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)試驗進(jìn)行研究。

5 結(jié)論

本試驗飼喂育肥期松遼黑豬添加不同濃度紅曲酶合生元的飼糧，并檢測血清蛋白、血清轉(zhuǎn)氨酶活性、血脂指標(biāo)以及背最長肌中MSTN、MyoD基因mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果表明：育肥期松遼黑豬飼糧中添加紅曲酶合生元，可以顯著降低血清膽固醇，改善肝臟功能，促進(jìn)育肥豬對蛋白代謝和沉積；可以顯著降低背最長肌中MSTN基因mRNA相對表達(dá)量，提高背最長肌中MyoD基因mRNA相對表達(dá)量，加強肌肉的沉積，提高瘦肉率。建議添加量為0.5%。