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    姬松茸提取物的降血糖作用及對糖尿病大鼠腸道菌群的影響

    2021-07-21 06:36:58鐘鑫榮陳炳智江玉姬
    中國食品學(xué)報 2021年6期
    關(guān)鍵詞:松茸血糖值菌門

    魏 奇,鐘鑫榮,陳炳智,江玉姬*

    糖尿病是由多基因和環(huán)境等因素綜合作用引起的,以高血糖為特征的內(nèi)分泌代謝疾病[1]。糖尿病引起的高血糖癥狀主要是由于機體胰島素產(chǎn)生抵抗作用,因此機體對胰島素的敏感性下降,從而導(dǎo)致血液中胰島的利用受阻,無法發(fā)揮其降血糖作用。如果長期處于高血糖狀態(tài),就會導(dǎo)致機體內(nèi)部各種組織,特別是眼、腎、心臟、血管及神經(jīng)系統(tǒng)的慢性損害和功能障礙[2-3]。雖然目前臨床上有大量的西藥能在短期內(nèi)有效控制血糖,但是其毒副作用大,無法防止糖尿病慢性并發(fā)癥的危害。鑒于此,開發(fā)具有毒副作用小、療效穩(wěn)定等特點的天然降血糖活性物質(zhì)引起人們的高度關(guān)注[4]。

    姬松茸(Agaricus blazei Murrill)作為食藥用菌,味道鮮美,營養(yǎng)豐富,有著很高的藥用價值。如其具有提高免疫力、抑制腫瘤和強化化療藥物的治療等作用[5]。本研究建立糖尿病大鼠模型,研究姬松茸提取物對糖尿病大鼠的降血糖作用和對腸道菌群的影響,為進一步研究其作用機制提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料、實驗動物與試劑

    姬松茸:福建古田盛耳食品有限公司。

    實驗動物:雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,8周齡,體重(200±20)g,由南京軍區(qū)福州總醫(yī)院提供。

    試劑:水合氯醛、鏈脲佐菌素(STZ),美國Sigma 公司;蘇木素伊紅染色試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;TIANamp Soil DNA kit 抽提試劑盒,田根生化科技(北京) 有限公司;QIAquick Gel Extraction Kit,德國QIAGEN 公司;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙醇、吐溫-80、氯化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、生理鹽水等試劑,購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司,純度為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    HGM-114 血糖儀、AS1 血糖測試紙,歐姆龍自動化有限公司;SpectraMax i3X 多功能酶標(biāo)儀,美國Molecular Devices 公司;StepOne 型熒光定量PCR 儀,美國Thermo 公司;DYY-6C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀,北京六一儀器廠;PCR 反應(yīng)擴增儀,美國Bio-Rad 公司;HiSeq 測序儀,美國Illumina 公司;Heraeus Megafuge 8R 臺式離心機,美國Thermo公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 姬松茸提取物的制備 姬松茸干制品放入60 ℃鼓風(fēng)干燥箱烘干2 h,粉碎過80 目篩,稱取1 kg 姬松茸粉末,放入中藥多功能提取罐中進行熱回流提取,無水乙醇浸提3 次,每次3 h,提取溫度70 ℃,提取劑體積50 L。真空抽濾處理,去除提取液殘渣。在溫度45 ℃條件下,將乙醇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干即得姬松茸乙醇提取物(EE)。取一部分乙醇提取物用水溶解,再用乙酸乙酯萃取3 次(料液比1∶3,時間2 h),合并有機相,在溫度45 ℃條件下,將乙酸乙酯旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干即得姬松茸乙酸乙酯提取物(EA)。

    1.3.2 糖尿病大鼠的建立 健康SD 大鼠購入后,基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),自由飲水,每籠4 只,在溫度(23±2)℃、濕度(50±10)%以及12 h 明暗循環(huán)(光照8:00-20:00)的條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。1 周后全部大鼠禁食(不禁水)12 h。正常組大鼠給予腹腔注射檸檬酸緩沖液,剩余大鼠腹腔注射STZ 溶液(STZ 溶液用檸檬酸緩沖溶液配制),劑量為55 mg/kg。注射3 d 后,大鼠禁食(不禁水)12 h,測定空腹血糖值和體重,空腹血糖值高于11.1 mmol/L即認為是糖尿病大鼠。

    1.3.3 分組及給藥 本試驗所使用的SD 大鼠總共42 只,包括36 只糖尿病鼠和6 只正常大鼠。36只情況良好的糖尿病大鼠,根據(jù)血糖和體重隨機分為6 組,每組6 只,正常組由6 只正常大鼠組成。正常對照組(N)和模型對照組(M)灌胃生理鹽水,陽性對照組灌胃格列鎂脲(P)0.1 mg/kg,高、低劑量組分別按500,250 mg/kg 灌胃姬松茸乙醇提取物(EH 和EL)和姬松茸乙酸乙酯提取物(AH 和AL)。所有試驗操作遵循Specific Pathogen Free動物飼養(yǎng)房的飼養(yǎng)規(guī)程,每天給大鼠更換干凈的墊料。每天9:00 灌胃一次,連續(xù)28 d。所有大鼠,正常喂食、喂水。次日測血糖值時,則前1 天需要禁食(不禁水)。

    1.3.4 大鼠一般特征的觀察 觀察試驗過程中大鼠的精神活動狀況、毛發(fā)改變情況、進食量、飲水量、排尿量以及排便量,并記錄大鼠體重的變化情況。體重:試驗期間,記錄第0、7、14、21 天和28 天大鼠體重。從而計算給藥體積,同時可以進行比較各組間體重的差異。

    1.3.5 空腹血糖檢測 空腹血糖:各組大鼠在第0 天和28 天禁食12 h(不禁水),于次日上午9:00進行血糖檢測。采用尾尖取血的方式,用歐姆龍血糖儀進行檢測。

    1.3.6 肝臟組織HE 染色 取大鼠肝臟組織用4%多聚甲醛固定48 h 后,經(jīng)透明、浸蠟、包埋、切片處理,切片的厚度約為4 μm。用蘇木素染色5 min,水洗3~5 s,伊紅染液染色2 min,水洗后滴加中性樹膠進行封片,自然晾干,用顯微鏡觀察組織變化,拍照記錄。

    1.3.7 腸道菌群的檢測 提取盲腸內(nèi)糞便樣本的DNA,以稀釋后的基因組DNA 為模板,根據(jù)測序區(qū)域的選擇,使用帶Barcode 的特異引物,New England Biolabs 公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 和高效高保真酶進行PCR,確保擴增效率和準(zhǔn)確性。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 和q-PCR 定量。文庫合格后,使用HiSeq 2500 PE 250進行測序。

    1.3.8 統(tǒng)計學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析(ANOVA),利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行比較分析,P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)顯著意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 姬松茸提取物對糖尿病大鼠一般體征的影響

    為了研究姬松茸提取物對糖尿病大鼠的影響,采用STZ 誘導(dǎo)SD 大鼠建立糖尿病的大鼠模型評估姬松茸提取物的降血糖活性。N 組的大鼠毛發(fā)純白有光澤,活動頻繁,精神狀態(tài)良好,鼠籠墊料干燥;M 組的大鼠毛發(fā)稀落枯黃、粗糙欠光澤,豎毛弓背,精神萎靡,尾巴濕冷,墊料潮濕。由此可以看出糖尿病大鼠外觀形態(tài)發(fā)生改變。如圖1a 所示,N 組的大鼠體重在試驗過程中逐步增加,造模成功后的糖尿病大鼠體重急劇下降。從圖1b、c、d 可知,糖尿病大鼠的食物攝入量(52 g±3 g)、排尿量(281 mL±48 mL)和排便量(22 g±2 g)與正常組食物攝入量(26 g±1 g)、排尿量(14 mL±6 mL)和排便量(8 g±3 g)相比顯著增加(P<0.05)。糖尿病大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食且消瘦典型的糖尿病癥狀。給予姬松茸提取物或格列美脲后,STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的體重?zé)o明顯增加,但是大鼠的毛發(fā)變得更加潤澤,活動增多,排尿量有所緩解,精神狀態(tài)有所改善,“三多一少”的癥狀有所減輕,說明姬松茸提取物能夠在一定程度上改善糖尿病大鼠的生活狀態(tài)。

    圖1 姬松茸提取物對大鼠狀態(tài)的影響Fig.1 Effects of Agaricus blazei Murrill extracts on rats related parameters

    2.2 姬松茸提取物對糖尿病大鼠空腹血糖的影響

    空腹血糖值作為糖尿病最常規(guī)的檢測指標(biāo),能夠反映糖代謝是否紊亂及胰島β 細胞功能是否良好。如圖2a 可知,第0 天時,M 組和姬松茸提取物給藥組在空腹血糖指標(biāo)上無顯著差異(P>0.05)。與N 組相比,M 組大鼠的空腹血糖值顯著增加(P<0.05),此時糖尿病大鼠的空腹血糖值大于11.1 mmol/L,表明造模成功。給藥后第28 天(圖2b),EH 組和EL 組的空腹血糖值分別為(24.6±1.5)mmol/L 與(22.6±4.1)mmol/L,與M 組的空腹血糖值(26.2±4.1)mmol/L 相比有所減少,但在統(tǒng)計學(xué)上沒有差異(P>0.05)。AH 組和AL 組的空腹血糖值分別為(17.0±4.8) mmol/L 和(17.3±2.8)mmol/L,與M 組的空腹血糖值(26.2±4.1)mmol/L相比,下降了9.2 mmol/L,差異顯著(P<0.05),表明EA 具有明顯的降糖效果。由此說明EA 體內(nèi)降血糖作用比EE 好,并且不同劑量的EA(AH 組和AL 組)對糖尿病大鼠都有顯著的降低空腹血糖值作用(P<0.05)。

    圖2 姬松茸提取物對大鼠空腹血糖水平的影響Fig.2 Effects of Agaricus blazei Murrill extracts on fasting blood glucose levels in rats

    2.3 姬松茸提取物對糖尿病大鼠肝臟組織病理學(xué)形態(tài)的影響

    肝臟組織HE 染色結(jié)果如圖3所示,N 組的大鼠肝小葉規(guī)則,肝細胞形態(tài)正常,胞核居中且清晰可見,索狀排列整齊,呈放射狀分布。M 組的大鼠肝索單層排列紊亂,肝細胞明顯腫大,胞質(zhì)淡染呈現(xiàn)疏松顆粒狀并有空亮區(qū),中央靜脈旁可見巨噬細胞,肝細胞出現(xiàn)炎癥。相比之下,經(jīng)姬松茸提取物干預(yù)后,糖尿病大鼠肝臟細胞腫脹部分得到恢復(fù),壞死及炎癥細胞減少,炎癥癥狀有所減輕,說明姬松茸提取物對糖尿病大鼠肝臟組織具有保護和修復(fù)作用。

    圖3 肝臟組織HE 染色(×200)Fig.3 HE staining of the liver in rats(×200)

    2.4 姬松茸提取物對糖尿病大鼠腸道菌群的影響

    2.4.1 大鼠腸道菌群多樣性分析 各組樣品的相關(guān)多樣性指數(shù)見表1。如表1所示,模型組的腸道菌群OUT、ACE、Chao、Shanon 指數(shù)低于正常組,由此說明經(jīng)STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的腸道菌群多樣性降低,腸道菌群豐度下降。與M 組相比,姬松茸提取物能夠提高ACE、Chao 和Shannon 指數(shù)。由此可知,姬松茸提取物能夠增加糖尿病大鼠腸道菌群的多樣性。

    表1 大鼠腸道菌群的豐度和α 多樣性Table 1 Abundance and α diversity of gut microbiota in rats

    2.4.2 大鼠腸道微生物種群的結(jié)構(gòu)分析 如圖4顯示了各組樣品腸道菌群在門水平上相對豐度的情況。如圖4a 所示,在門水平上,各組腸道菌群主要細菌為:厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、螺旋體門(Spirochaetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和柔膜菌門(Tenericutes)。厚壁菌門和擬桿菌門在糖尿病大鼠和健康大鼠中均為主要優(yōu)勢菌種。由圖4b 可知,模型組中厚壁菌門和擬桿菌門所占比例較大,分別為57%和24%。與正常組相比,模型組擬桿菌門的豐富度顯著增加(P<0.05)。與M 組相比,EL組大鼠的盲腸內(nèi)容物樣品中擬桿菌門相對豐度顯著增加(P<0.05),厚壁菌門相對豐度變化不顯著(P>0.05);EH 組大鼠的盲腸內(nèi)容物樣品中腸道菌群相對豐度變化不明顯;AH 組大鼠的盲腸內(nèi)容物樣品中擬桿菌門相對豐度顯著增加,厚壁菌門相對豐度減少(P<0.05)。

    圖4 姬松茸提取物對大鼠腸道菌群的影響Fig.4 Effects of Agaricus blazei Murrill extracts on relative abundance of gut microbiota in rats

    2.4.3 大鼠腸道微生物群聚類分析 根據(jù)各組樣品的豐度信息,其腸道菌群在門水平的熱圖檢測結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,各組顯著富集的菌群結(jié)構(gòu)存在比較大的差異。與N 組相比,M 組的梭桿菌門和廣古菌門豐度上調(diào);與M 組相比,AH,AL,EH 和EL 組梭桿菌門和廣古菌門豐度下調(diào),由此推測姬松茸提取物對梭桿菌門和廣古菌門豐度的影響較大。與M 組相比,AH 組能夠上調(diào)黏膠球形菌門(Lentisphaerae)和互養(yǎng)菌門(Synergistetes)豐度;EH 組能夠上調(diào)藍藻細菌門(Cyanobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)豐度。

    圖5 樣品在門水平上的熱圖Fig.5 Heatmap of samples at phylum level

    3 討論

    糖尿病是常見的代謝疾病,糖尿病因高患病率和高死亡率成為危害人體健康的主要疾病[6-7]。姬松茸在降血糖方面表現(xiàn)出良好的效果,段縣平等[8]報道了姬松茸多糖能夠降低糖尿病小鼠的血糖值。Oh 等[9]研究發(fā)現(xiàn)姬松茸發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物主要活性成分為類黃酮(染料木素、染料木苷和大豆黃素),能夠有效降低STZ 誘導(dǎo)的雄性SD 大鼠血液葡萄糖含量,增加血清胰島素含量和GLUT4 蛋白的含量,從而達到降低血糖的作用。Hsu 等[10]發(fā)現(xiàn),姬松茸與二甲雙胍和格列齊特降糖藥復(fù)合使用12 周后,可以降低糖尿病機體的胰島素抵抗作用。本試驗發(fā)現(xiàn)灌胃姬松茸提取物可以降低糖尿病大鼠的血糖值,這與李龍[11]的研究結(jié)果基本一致。他們用姬松茸粉末制成小鼠飼料喂養(yǎng)8 周可以降低糖尿病小鼠的空腹血糖值,改善糖尿病小鼠的糖代謝。結(jié)果表明,姬松茸提取物具有降血糖作用。

    本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中觀察到厚壁菌門豐度增加,變形菌門豐度減小,說明STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠會引起腸道菌群在門水平上發(fā)生紊亂,腸道菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。該研究結(jié)果與Backhed 等[12]的研究結(jié)果一致,糖尿病能夠?qū)е履c道菌群在門水平上發(fā)生變化,增加厚壁菌門的數(shù)量。Matsuzaki 等[13]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌干預(yù)糖尿病小鼠可以降低糖尿病小鼠的血糖值,修復(fù)胰島細胞功能。Tabuchi 等[14]利用鼠李糖乳桿菌干預(yù)糖尿病大鼠2 個月,能夠促進糖尿病大鼠胰島素的分泌,降低糖化血紅蛋白水平和改善葡萄糖耐受癥狀。Vrieze 等[15]研究發(fā)現(xiàn),從健康者體內(nèi)轉(zhuǎn)移糞便給胰島素抵抗代謝綜合征患者后,可以提高胰島素抵抗代謝綜合征患者的胰島素敏感性,以上研究結(jié)果充分提示腸道菌群對改善糖尿病患者胰島素抵抗和血糖水平具有積極作用。

    綜上所述,姬松茸提取物能夠有效降低糖尿病大鼠的血糖值,保護和修復(fù)糖尿病大鼠肝臟組織。與模型組相比,姬松茸提取物能增加腸道菌群的多樣性,改善腸道菌群的結(jié)構(gòu)。通過腸道菌群與糖尿病關(guān)系的研究有望為早期預(yù)防、控制和治療糖尿病提供新的理論依據(jù)和治療途徑。

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