腎衰方及其拆方對腎間質(zhì)纖維化Wnt4、β-catenin蛋白表達的影響

沈金峰 羅富里 黃偉 晏子友

江西中醫(yī)藥大學（南昌330006）

腎間質(zhì)纖維化是各類慢性腎系疾病進展終末腎衰竭的的共同病理改變。抑制腎間質(zhì)纖維化的病理進程是減緩慢性腎臟病進展的主要治療方法。EMT 參與腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的關(guān)鍵步驟，如果能阻斷EMT 形成過程，那么可以阻斷腎纖維化的進程。Wnt∕β-catenin 信號通路是目前研究細胞EMT調(diào)控機制中三條主要通路之一。研究發(fā)現(xiàn)Wnt∕β-catenin 信號通路參與慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展，誘導腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展［1］。抑制Wnt4、β-catenin蛋白的表達可能成為治療腎間質(zhì)纖維化的靶點。單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠模型是目前研究腎小管間質(zhì)進行性纖維化較為成熟的一種實驗性動物模型［2］。腎衰方是治療慢性腎臟病常用的臨床經(jīng)驗方，我們前期研究己證明其具有抗腎間質(zhì)纖維化的作用。腎衰方由補虛藥物及祛邪藥物組成，具有祛邪扶正的作用，利用其復方及拆方可進一步證明腎間質(zhì)纖維化是否為本虛標實之證。研究采用UUO 誘導腎間質(zhì)纖維化小鼠模型，觀察腎衰方及其拆方對Wnt4、β-catenin 蛋白的表達影響及探討腎間質(zhì)纖維化中醫(yī)是否屬于本虛標實之證，為臨床上應(yīng)用腎衰方延緩腎間質(zhì)纖維化進展提供依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組與造模 SPF 級雌性大鼠72 只（購于浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，合格證號：SCSK（浙）20170001），體質(zhì)量180～200 g，適應(yīng)1 周，尿蛋白陰性者方可使用。隨機分為：（1）假手術(shù)組；（2）模型組；（3）腎衰方組；（4）補虛方組；（5）袪邪方組；（6）貝那普利組，每組12 只。UUO大鼠模型制備參考文獻［3］進行，用5.0%水合氯醛（10 mL∕kg 體質(zhì)）腹腔注藥麻醉后，進行輸尿管游離，從輸尿管上1∕3 與下2∕3 處進行結(jié)扎，分層縫合肌肉、皮膚層即制備得UUO 動物模型。假手術(shù)組只是分離左側(cè)輸尿管但是不予結(jié)扎。

1.2 實驗用藥 腎衰方組（生黃芪30 g、六月雪20 g、生大黃后下10 g、淫羊藿15 g、白花蛇舌草20 g、生地10 g、淮山藥15 g、山萸肉10 g、丹參20 g、澤瀉10 g、土茯苓20 g、黨參15 g 共13 味中藥）、補虛方組（生黃芪30 g、黨參15 g、生地10 g、山萸肉10 g、山藥15 g、淫羊藿15 g 共7味中藥）、袪邪方組（生大黃10 g、丹參20 g、白花蛇舌草20 g、六月雪20 g、土茯苓20 g、澤瀉10 g 共6 味中藥）3組，以上中藥都是經(jīng)過江西中醫(yī)藥大學中藥飲片廠專家鑒定后進行采用，將上述中藥組進行煎煮，然后進行濃縮，將腎衰方組、補虛方組、祛邪方組分別制成每mL 含生藥量1.2 g、0.4 g、0.8 g，4 ℃冰箱保存。鹽酸貝那普利（商品名：洛丁新），規(guī)格10 mg∕片，批號：H2003014，從北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)后購買。

兔抗大鼠β-catenin 多克隆抗體、兔抗大鼠Wnt4 多克隆抗體，以1∶100 稀釋。Masson 染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒、免疫組化超敏SP 試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供；磷酸緩沖液（PBS）由檸檬酸緩沖液由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 治療方法 手術(shù)后3 d，各中藥組及貝那普利大鼠給藥均按10 倍于臨床用藥劑量折算為等效劑量給藥，即腎衰方組、補虛方組、祛邪方組大鼠分別按分別按1.95、0.95、1.00 g∕mL 腎衰方濃縮劑給藥，即給藥劑分別為19.5、9.5、10.0 g∕（kg·d）進行灌胃；予貝那普利組給貝那普利1.5 mg∕（kg·d）進行灌胃，假手術(shù)組、模型組大鼠給等量生理鹽水灌胃。術(shù)后7、14 d 分別處死各組大鼠。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 一般情況觀察 觀察各組大鼠食欲、體質(zhì)量、計算左腎（術(shù)側(cè)）濕重、腎臟器系數(shù)（腎濕重∕質(zhì)量×100%）；

1.4.2 24 h 尿蛋白定量測定 處死大鼠前1 d 各組大鼠分別用大鼠金屬代謝籠收集24 h 尿液標本，留尿期間禁食，不禁水，記錄尿量后取4 mL，2 000 r∕min 離心10 min，去除沉渣并于-20 ℃保存待測。24 h 尿蛋白定量用雙縮脲法測定。

1.4.3 腎功能檢測 全自動生化儀測定血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、24 h 尿蛋白定量（24 h UP）。

1.4.4 腎組織學檢查 大鼠處死后，馬上分離梗阻側(cè)腎臟，進行稱量重量。用4%甲醛溶液將腎組織全部浸潤，使其脫水，用石蠟包埋裹，將其制備成厚度大概為4 μm 切片，再通過HE 和Masson 染色，觀察腎臟組織光鏡下的改變。

1.4.5 腎小管損傷程度評分及腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)測定 HE 染色評定：運用顯微鏡（光鏡）進行觀察（× 400 倍），根據(jù)每個視野腎小管病變（腎小管上皮細胞空泡變性、腎小管擴張、腎小管萎縮、紅細胞管型、蛋白管型、間質(zhì)水腫、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)炎性細胞浸潤等）累及的小管數(shù)目評定腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)損傷按Banff 分級進行0～3 級半定量計分［4］，0 分：腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見病變；1 分：腎小管病變數(shù)目＜3 個；2 分：腎小管病變數(shù)目3～5 個；3 分：腎小管病變數(shù)目＞5 個或腎小管結(jié)構(gòu)消失。Masson 染色半定量分析：在400 倍視野下，每只大鼠選取梗阻側(cè)腎組織5 張切片，每張切片隨機選擇10 個不相重疊視野的腎小管皮質(zhì)處，然后計算其平均值［5］。通過觀察整個視野中膠原染色陽性面積所占總面積的百分比評判腎間質(zhì)纖維化指數(shù)，評分如下：0 分，纖維化陽性面積＜2%；1 分，纖維化陽性面積2%～10%；2 分，纖維化陽性面積11%～20%；3 分，纖維化陽性面積21%～30%；4 分，纖維化陽性面積＞30%。

1.4.6 免疫組化檢測 用SP 法檢測實驗大鼠腎間質(zhì)Wnt4、β-catenin 的蛋白表達。每組取6 只（7 和14 d 各6 只）大鼠的術(shù)側(cè)腎臟，嚴格按SP 試劑盒說明進行免疫組化技術(shù)操作，用PBS 代替一抗作陰性對照，DAB 顯色，蘇木素復染。免疫組化結(jié)果借助用Image-Pro Plus 5.0 圖像分析軟件進行計算機圖象分析。每張切片隨機選取5 個高倍視野（×400），對所選視野內(nèi)的免疫組化陽性信號經(jīng)計算機圖像分析，通過積分吸光度值反映蛋白表達的高低。

1.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS 19.0 軟件包進行統(tǒng)計學分析。連續(xù)型變量采用均數(shù)±標準差進行統(tǒng)計學描述。組間比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察及病理檢查 外觀性觀察：模型組大鼠的皮毛松軟、灰暗，消瘦，厭食，少動。腎衰方組、祛邪方組、補虛方組、貝那普利組大鼠的食量、體質(zhì)量、存活率、活動狀況等無明顯差異，但比模型組稍好。

肉眼觀察：假手術(shù)組術(shù)側(cè)大鼠腎臟紅潤、柔軟，其7、14 d 時未見明顯改變；UUO組大鼠造模術(shù)側(cè)腎臟體積大于對側(cè)，顏色變淡，剖面表現(xiàn)出缺血狀，腎皮質(zhì)為尤為明顯。腎實質(zhì)變薄，皮髓質(zhì)邊界模糊不清，腎盂、腎盞擴張，內(nèi)含尿液，術(shù)后7 d 變化不明顯，術(shù)后第14 d 出現(xiàn)明顯變化。模型組及腎衰方組、祛邪方組、補虛方組、貝那普利組大鼠術(shù)側(cè)腎臟顏色淺白，表面覆蓋一層薄而萎縮樣的物質(zhì)，其內(nèi)含有液體，腎乳頭表現(xiàn)為空洞狀，與假手術(shù)組相比各治療組腎濕重降低。非術(shù)側(cè)大鼠腎臟術(shù)后7、14 d 較假手術(shù)組變化不明顯。與模型組相比，腎衰方組、祛邪方組、補虛方組、貝那普利組術(shù)側(cè)大鼠腎臟顏色、質(zhì)量、濕度、積液有著不同程度的改善。

各組大鼠左側(cè)腎腎臟器系數(shù)（腎濕重∕體質(zhì)量×100%）比較：與假手術(shù)組，同時期模型組左腎臟器指數(shù)顯著升高（P＜0.05），表明左腎衰竭模型制備成功。與模型組相比，經(jīng)治療后，腎衰方及其拆方組和貝那普利組左腎腎臟器指數(shù)下降（P＜0.05），其中第14 天腎衰方組大鼠術(shù)側(cè)腎腎臟器系數(shù)明顯低于其他3 個治療組（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠術(shù)側(cè)腎臟組織Wnt4、β-catenin 蛋白表達比較 如圖1、2 所示，假手術(shù)組大鼠在腎小球系膜細胞、腎小管細胞見少量Wnt4 蛋白表達，β-catenin 蛋白僅少量表達于腎小管上皮細胞基底側(cè)。造模后各組大鼠Wnt4、β-catenin 蛋白表達明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），并隨著梗阻時間延長，其表達隨之增強。經(jīng)干預治療后，各治療組大鼠Wnt4、β-catenin 蛋白表達顯著低于模型組，但明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）；其中腎衰方組明顯低于其他3 個治療組（P＜0.05），見表2。

表1 各組大鼠術(shù)側(cè)腎腎臟器系數(shù)變化比較Tab.1 Changes of renal and renal organ coefficients in each group of rats ±s

表1 各組大鼠術(shù)側(cè)腎腎臟器系數(shù)變化比較Tab.1 Changes of renal and renal organ coefficients in each group of rats ±s

注：與同時期模型組比較，*P ＜0.05；同時期與各治療組比較，#P＜0.05；14 d 時與其他3 個治療組比較，△P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組腎衰方組祛邪方組補虛方組貝那普利組天數(shù)（d）7 14 7 14 7 14 7 14 7 14 7 14體質(zhì)量（g）197.27±13.41 210.10±12.51 217.60±11.63 250.32±17.04 200.75±9.80 220.73±19.94 202.61±7.53 223.92±13.27 205.82±9.01 231.52±19.95 207.10±7.22 237.21±18.73左腎重（g）1.77±0.18 2.30±0.21 1.15±0.18 1.39±0.076 1.41±0.090 2.05±0.25 1.37±0.093 2.01±0.091 1.31±0.063 1.92±0.096 1.29±0.057 1.85±0.061左腎器官指數(shù)（%）0.61±0.05#0.63±0.03#1.70±0.13*2.10±0.27*1.03±0.17 1.32±0.10△1.39±0.23 1.74±0.35 1.40±0.14 1.68±0.27 1.36±0.24 1.58±0.27

表2 各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin 蛋白表達Tab.2 Expression of Wnt4 and beta-catenin in renal tissues of rats in each group ±s

表2 各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin 蛋白表達Tab.2 Expression of Wnt4 and beta-catenin in renal tissues of rats in each group ±s

注：與同時期模型組及各治療組比較，*P＜0.05；與同時期各治療組比較，#P＜0.05；與同時期其他治療組比較，△P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組腎衰方組祛邪方組補虛方組貝那普利組天數(shù)（d）7 14 7 14 7 14 7 14 7 14 7 14 Wnt4 1.2±0.32*3.10±0.88*7.88±1.56#10.05±1.23#4.10±0.89 5.10±0.66△5.22±0.76 6.58±1.20 4.62±0.91 6.91±0.81 5.63±0.76 6.88±0.69 β-catenin 3.0±0.58*4.30±0.66*8.54±1.32#13.62±0.77#4.54±0.66 5.48±0.59△6.10±0.88 8.35±1.13 6.13±1.74 8.78±1.44 5.98±1.23 8.11±1.45

2.3 各組大鼠BUN、Scr、24 h UP 水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組Scr、BUN 水平和24 h UP 升高（P＜0.05），經(jīng)腎衰方、祛邪方、補虛方及貝那普利治療后均有所改善（P＜0.05），14 d 腎衰方在降低Scr、BUN 水平和24 h UP 優(yōu)于祛邪方、補虛方及貝那普利，表明腎衰方可以改善UUO 大鼠的腎功能及降低尿蛋白的作用，保護腎臟。見表3。

圖1 Wnt4 免疫組化結(jié)果Fig.1 Immunohistochemical results of Wnt4

圖2 β-catenin 免疫組化結(jié)果Fig.2 Immunohistochemical results of β-catenin

表3 各組大鼠血清SCr、BUN 水平和24 h UP 的比較Tab.3 SCr、BUN and 24 h UP data of rats in each group ±s

表3 各組大鼠血清SCr、BUN 水平和24 h UP 的比較Tab.3 SCr、BUN and 24 h UP data of rats in each group ±s

注：與同時期模型組及各治療組比較，*P＜0.05；與同時期各治療組比較，#P＜0.05；與同時期其他治療組比較，△P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組腎衰方組祛邪組補虛組貝那普利組BUN（mmol∕L）7 d 6.21±1.46*11.12±1.42#8.10±0.41 9.66±0.87 9.42±0.79 8.26±0.54 14 d 7.56±1.26*12.48±1.56#5.88±0.76△6.92±0.82 6.88±0.77 6.11±0.85 SCr（μmol∕L）7 d 25.38±4.42*60.46±10.54#40.43±5.28△50.29±7.22 51.28±8.38 44.76±6.10 14 d 31.73±5.28*67.32±14.24#39.86±4.80△49.31±6.21 49.47±9.64 45.63±2.61 24 h UP（mg）7 d 3.10±1.01*10.54±3.26#8.39±1.39 9.84±1.21 9.48±1.58 9.83±1.06 14 d 4.05±1.42*13.67±2.52#5.72±0.48△8.10±0.70 8.26±0.83 6.91±0.88

2.4 大鼠腎臟病理改變 如圖3所示，HE 染色見假手術(shù)組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管排列緊密，腎小管周圍間質(zhì)無增寬；模型組大鼠術(shù)后第7 天起觀察到腎小管管腔擴張，腎小管周圍間質(zhì)增寬、水腫并伴有大量炎性細胞浸潤，隨梗阻時間延長更加嚴重。但梗阻早期（術(shù)后第7 天）腎小球結(jié)構(gòu)相對完整，各治療組大鼠較同期模型組上述病變有所改善。與假手術(shù)相比模型組腎小管損傷程度顯著升高（P＜0.05），經(jīng)腎衰方、祛邪方、補虛方、貝那普利治療后腎小管損傷程度與模型組比較顯著降低（P＜0.05），且第14 天腎衰方組大鼠腎小管損傷程度評分低于其他3 個治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。如表4、圖4所見，Masson染色見假手術(shù)組大鼠腎小球基底膜、系膜區(qū)及腎小管間質(zhì)無明顯膠原沉積；模型組大鼠腎組織可見條索狀膠原，呈藍紫色，梗阻時間越長越明顯。模型組較假手術(shù)組膠原沉積顯著升高（P＜0.05），腎衰方組、祛邪方組、補虛方組、貝那普利組與模型組比較均下降（P＜0.05），且第14 天腎衰方組腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)明顯低于其他3 個治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠腎小管損傷程度評分及腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)Tab.4 HE and Masson scores in each group of rats x±s

3 討論

筆者認為腎間質(zhì)纖維化的病機歸納為“虛”、“濕”、“瘀”、“毒”四個方面，“虛”是始因，濕、瘀是腎間質(zhì)纖維化微型癥積形成的病理基礎(chǔ)，而毒促進腎間質(zhì)纖維化的進展。腎間質(zhì)纖維化為本虛標實之證，治療需標本兼顧，但不同時期各有側(cè)重。在早期，標實為主，以祛濕泄?jié)幔钛鰹榉?，到了晚期，正氣耗傷，當以扶正為主，補益脾腎，泄?jié)峤舛尽２C關(guān)鍵是“脾腎虧虛、濕濁內(nèi)蘊，瘀毒閉阻”，故治療以益腎健脾、化瘀利濕、解毒泄?jié)釣榉?。腎衰方正是依據(jù)此病機研制而成，由生黃芪、生地、黨參、山萸肉、淮山藥、丹參、澤瀉、土茯苓、白花蛇舌草、蒲公英、六月雪、生大黃、淫羊藿組成，具有標本兼顧的作用。腎衰方為參芪地黃湯化裁而來。方中用丹參換丹皮提高起活血化瘀的作用，人參用黨參替代以補益中氣，黨參配黃芪益氣健脾，生地滋養(yǎng)陰血、山萸肉補益肝腎、山藥固腎健脾、淫羊藿溫腎助陽，以上諸藥可益氣健脾固腎，顧護其本；佐以生大黃，通臟腑，泄?jié)岫?、利瘀水，使?jié)岫緩哪c胃而出，白花蛇舌草、蒲公英解毒利水、六月雪健脾利濕，澤瀉活血利水、茯苓健脾滲濕，全方健脾益腎而祛濁毒，降濁毒而耗傷正氣，補中寓瀉，瀉中有補，以標本共奏的功效。補虛方組（生黃芪、黨參、生地、山萸肉、山藥、淫羊藿）、袪邪方組（生大黃、丹參、白花蛇舌草、六月雪、土茯苓、蒲公英、澤瀉），通過拆方進行治療，進一步佐證腎間質(zhì)纖維化是否為本虛標實之證。

圖3 各組大鼠腎組織HE 染色結(jié)果Fig.3 HE staining in renal tissues of rats in each group

圖4 各組大鼠腎組織Masson 染色結(jié)果Fig.4 Masson staining in renal tissues of rats in each group

Wnt∕β-catenin 是一種進化保守、高度復雜信號通路［6］。Wnt 信號通路主要的生理功能是按程序規(guī)律地激活和靜止，它分泌的糖脂蛋白，是生物正常組織分化的誘導信號［7］。β-catenin 作為經(jīng)典Wnt 信號通路的核心蛋白，參與細胞代謝的增殖、分化和凋亡過程，具有介導細胞間黏附和參與基因表達的功能［8］。β-catenin 作為一種細胞骨架蛋白［9］。β-catenin 又是Wnt4 信號途徑下游的關(guān)鍵效應(yīng)因子，Wnt 信號途徑能引起胞內(nèi)β-catenin 積累。正常機體腎臟中wnt4、β-catenin 信號是相對沉默。Wnt4 信號途徑廣泛參與腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展，特別是在腎間質(zhì)纖維化［10］。激活Wnt 信號在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機制至關(guān)重要［11］。慢性腎病大鼠腎組織的β-連環(huán)蛋白和細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達水平升高，β-catenin 沉默可能是一種有治療對腎纖維化疾病的干預策略［12］。越來越多的證據(jù)表明，持續(xù)激活Wnt∕β-catenin 與腎纖維化病變有著密切的聯(lián)系［13］。通過抑制Wnt∕β-catenin 信號轉(zhuǎn)導通路可能為治療腎纖維化提供新的突破口和干預靶點。

本實驗以貝那普利作為對照組，進一步觀察腎衰方對大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用。貝那普利為目前公認具有抗腎間質(zhì)纖維化作用的藥物。從實驗結(jié)果中，本研究發(fā)現(xiàn)腎衰方及其拆方和貝那普利都能抑制Wnt4、β-catenin 蛋白的表達，改善腎小管損傷程度及減輕腎小管纖維質(zhì)指數(shù)，改善腎功能，減輕腎臟損害，延緩慢性腎臟病進程，提示腎衰方及其拆方和貝那普利具有保護腎臟作用。且腎衰方抑制腎間質(zhì)纖維化效果優(yōu)于補虛方、祛邪方，可見單純補虛或單純祛邪抗腎間質(zhì)纖維化效果不佳，從腎衰方及其拆方的治療效果也進一步佐證了腎間質(zhì)纖維化屬于本虛標實之證，在治療上需標本同顧，方能起到較好治療效果。

中藥腎衰方抗腎間質(zhì)纖維化作用機制可能是通過抑制Wnt4、β-catenin 蛋白的表達，延緩腎間質(zhì)纖維化進展，改善腎功能，其中醫(yī)屬于本虛標實之證。