高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞TRAP1 的表達(dá)變化及意義

鐘禎 李萬(wàn)根 張霄旦

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科（廣州510260）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是常見(jiàn)的糖尿病心血管并發(fā)癥之一，是一種獨(dú)立于高血壓、冠心病的特異性心臟疾病，1972年被RUBLER 等［1］首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。DCM 增加糖尿病患者心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，是糖尿病患者死亡的主要原因之一［2］。DCM的發(fā)生、發(fā)展是多因素的，但高血糖環(huán)境下心肌細(xì)胞線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生超氧化物（reactive oxygen species，ROS）引起的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致DCM 的共同途徑［3］。ROS 可以誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開(kāi)放，釋放出細(xì)胞色素C等活性物質(zhì)，影響線粒體膜內(nèi)外電荷分布，降低線粒體膜電位，導(dǎo)致線粒體功能障礙。腫瘤壞死因子相關(guān)受體蛋白1（tumor necrosis factor receptorassociated protein 1，TRAP1）是一種定位于線粒體的熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）家族成員，具有抗氧化活性，在某些應(yīng)激或病理?xiàng)l件下線粒體穩(wěn)態(tài)維持中起重要作用［4］。TRAP1 可通過(guò)抑制ROS 的產(chǎn)生減輕氧化應(yīng)激從而保護(hù)細(xì)胞，減少細(xì)胞凋亡。目前對(duì)于TRAP1 的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，被認(rèn)為是線粒體功能的關(guān)鍵調(diào)控因子，有助于腫瘤細(xì)胞逃避死亡損傷［5-6］。目前TRAP1 在DCM 的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，相關(guān)機(jī)制尚不明確。

本研究通過(guò)檢測(cè)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞線粒體功能改變、心肌細(xì)胞活性變化以及高糖作用下心肌細(xì)胞TRAP1 表達(dá)。首次探討了DCM 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中TRAP1 的表達(dá)變化及作用，為尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 大鼠心肌細(xì)胞株H9c2 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞保藏庫(kù)；低糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)GIBCO 公司；D-Glucose、D-Mannitol 購(gòu)于Sigma 公司；PrimeScriptTMRT Master Mix 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Takara 公司；Applied BiosystemsTMPowerUpTMSYBRTMGreen Mix、Trizol 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；兔抗大鼠TRAP1 多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)于美國(guó)Genecopoeia 公 司；CellTiter 96?AQueous One Solution Assay（MTS）購(gòu)于美國(guó)Promega 公司；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）購(gòu)于碧云天。

1.2 H9c2 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組 大鼠心肌H9c2 細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的低糖DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)1∶3 傳代，生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組：正常糖對(duì)照組（C）：含5.5 mmol∕L 葡 萄 糖 的DMEM 培 養(yǎng) 基 處 理 細(xì) 胞48 h；高糖組（G）：含33.0 mmol∕L 葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞48 h；高滲組（M）：含5.5 mmol∕L葡 萄 糖+27.5 mmol∕L 甘 露醇 的DMEM 培 養(yǎng) 基處 理細(xì)胞48 h。

1.3 Western blot H9c2 細(xì)胞以1.5×105個(gè)∕孔的密度接種于六孔板中，培養(yǎng)12 h 貼壁，予不同葡萄糖濃度或甘露醇處理48 h 后，各組細(xì)胞加預(yù)冷的PBS 洗兩遍，加入蛋白裂解液，冰浴10 min 后將細(xì)胞從孔板中刮取下來(lái)，超聲破碎細(xì)胞后離心，取上清，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。加入5×Loading Buffer 后煮沸10 min，經(jīng)10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應(yīng)抗體4 ℃過(guò)夜。一抗工作濃度為T(mén)RAP1（1∶1 000），加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，加入發(fā)光液后放入化學(xué)發(fā)光成像分析儀中曝光。Image J 分析軟件分析各條帶灰度值，以檢測(cè)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)情況。

1.4 qRT-PCR H9c2 細(xì)胞以1.5 × 105個(gè)∕孔的密度接種于六孔板中，培養(yǎng)12 h 貼壁，予不同葡萄糖濃度或甘露醇處理48 h 后，每孔加入1 mL Trizol提取總RNA，用酶標(biāo)儀測(cè)定RNA 樣本純度及濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系30 μL。以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA 為模板，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)目的基因及3 個(gè)內(nèi)參基因平行試驗(yàn)，應(yīng)用LightCycler?480 進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 熒光定量檢測(cè)。目的基因mRNA 表達(dá)水平以2-ΔΔCT相對(duì)定量方法進(jìn)行分析。引物：TRAP1-F：5′-CTCAGTTGCTACAGCCCACA-3′；TRAP1-R：5′-CTGCTATCATGGCGTTCTCA-3′；GAPDH-F：5-AGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′；GAPDH-R：5-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。

1.5 MTS 檢測(cè)細(xì)胞活性 H9c2 細(xì)胞以5 000 個(gè)∕孔接種于96 孔板，按各組細(xì)胞處理方法處理相應(yīng)時(shí)間后，更換完全培養(yǎng)基100 μL ∕孔，每孔加入MTS 檢測(cè)試劑20 μL，輕輕搖勻，37 ℃孵育2 h，多功能酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度。

1.6 細(xì)胞內(nèi)ROS 檢測(cè) 以2′，7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鹽（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）為熒光探針檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作，熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光強(qiáng)度，以綠色熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，拍攝熒光圖。Image J 分析軟件對(duì)各組熒光圖進(jìn)行熒光半定量，以IntDen∕Area 的值表示細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

1.7 線粒體膜電位測(cè)定 運(yùn)用JC-1 熒光染色檢測(cè)心肌細(xì)胞線粒體膜電位變化，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，熒光倒置顯微鏡下觀察紅色熒光強(qiáng)度，以紅色熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平拍攝熒光圖。Image J 分析軟件對(duì)各組熒光圖進(jìn)行熒光半定量，以IntDen∕Area 的值表示細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖環(huán)境下H9c2 細(xì)胞低表達(dá)TRAP1 高糖組TRAP1 蛋白表達(dá)量較正常糖對(duì)照組及高滲組均減少（P＜0.05），而高滲組與正常對(duì)照組相比，TRAP1 蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。高糖組TRAP1 mRNA 表達(dá)水平較正常糖對(duì)照組及高滲組均下降（P＜0.05），高滲組與正常糖對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

圖1 高糖環(huán)境下H9c2 細(xì)胞TRAP1 蛋白表達(dá)情況Fig.1 Detection of protein expression of TRAP1 in H9c2 cells under hyperglycemia via Western blotting assays

2.2 高糖環(huán)境下H9c2 活性下降 高糖組心肌細(xì)胞活性低于對(duì)照組（P＜0.05），高滲組與正常糖對(duì)照組細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3。

2.3 高糖環(huán)境下H9c2 生成ROS 增多 高糖組綠色熒光強(qiáng)度較正常糖對(duì)照組及高滲組高（P＜0.05），而高滲組綠色熒光強(qiáng)度與正常糖對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4、5。

2.4 高糖環(huán)境下H9c2 細(xì)胞線粒體膜電位下降高糖組紅色熒光強(qiáng)度較正常糖對(duì)照組及高滲組高（P＜0.05），而高滲組紅色熒光強(qiáng)度與正常糖對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖6、7。

圖2 高糖環(huán)境下H9c2 細(xì)胞TRAP1 mRNA 表達(dá)情況Fig.2 Detection of mRNA expression of TRAP1 in H9c2 cells under hyperglycemia via RT-PCR

圖3 高糖環(huán)境下H9c2 細(xì)胞活性統(tǒng)計(jì)分析圖Fig.3 Detection of activity of H9c2 cells under hyperglycemia via MTS

圖4 各組細(xì)胞加載DCFH-DA 熒光探針后顯色，熒光倒置顯微鏡拍攝熒光圖Fig.4 Detection of of H9c2 cells under hyperglycemia via DCFH-DC

3 討論

糖尿病心血管并發(fā)癥是糖尿病患者致死的主要原因，DCM 早期階段表現(xiàn)為舒張功能障礙，后期表現(xiàn)為獨(dú)立于血脂異常、高血壓和冠狀動(dòng)脈疾病的心力衰竭。胰島素抵抗、高胰島素血癥和高血糖是DCM 發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［7］。DCM 的發(fā)病機(jī)制主要包括全身代謝紊亂、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的異常激活、氧化應(yīng)激、炎癥和功能失調(diào)性免疫調(diào)節(jié)等［8］。這些異常共同促進(jìn)心臟纖維化，由無(wú)癥狀的心臟舒張功能障礙進(jìn)展為心室順應(yīng)性下降、收縮功能障礙，導(dǎo)致臨床心力衰竭。其中，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是DCM 發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)因素。DCM 時(shí)氧化應(yīng)激增強(qiáng)，ROS 生成增加，過(guò)氧化氫增加，同時(shí)過(guò)氧化氫酶活性下降［9］。高血糖及波動(dòng)的血糖水平可誘發(fā)急性的氧化應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激-抗氧化應(yīng)激平衡失調(diào)，ROS 和活性氮生成過(guò)多和清除不足，過(guò)量ROS 在細(xì)胞內(nèi)蓄積，可以誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開(kāi)放，釋放出細(xì)胞色素C 等活性物質(zhì)，影響線粒體膜內(nèi)外電荷的分布，使線粒體膜電位降低，引起細(xì)胞功能障礙及細(xì)胞凋亡［10-11］。

圖5 各組綠色熒光圖熒光半定量統(tǒng)計(jì)分析圖Fig.5 Green fluorescence semi-quantitative statistical analysis

圖6 各組細(xì)胞加載JC-1 熒光探針后顯色，熒光倒置顯微鏡拍攝熒光圖Fig.6 Detection of mitochondrial membrane potential of H9c2 cells under hyperglycemia via DCFH-DC

圖7 各組紅色熒光圖熒光半定量統(tǒng)計(jì)分析圖Fig.7 Red fluorescence semi-quantitative statistical analysis

TRAP1 最早是通過(guò)酵母的雙雜交篩選鑒定，作為與腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的新蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)。與此同時(shí)，另一次的篩選發(fā)現(xiàn)TRAP1 和HSP90 蛋白家族成員之間具有34%的序列同一性和60%同源性，證明其是HSP90 家族的新成員，具有熱休克蛋白家族的一般性質(zhì)，參與細(xì)胞蛋白修飾等生理過(guò)程［12］。TIAN 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，敲低體外食管癌細(xì)胞系ECA109 和EC9706 中的TRAP1 表達(dá)可誘導(dǎo)ROS 和線粒體去極化的增加，使得細(xì)胞周期阻滯于G2∕M期，抑制細(xì)胞增殖，重新表達(dá)TRAP1可恢復(fù)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。IM 等［14］用鐵螯合劑去鐵胺處理正常人肝細(xì)胞系Chang 細(xì)胞，觀察到細(xì)胞TRAP1 表達(dá)減少，同時(shí)ROS 的產(chǎn)生增加。過(guò)表達(dá)TRAP1 可減弱去鐵胺的作用，減少了ROS 的產(chǎn)生。這些結(jié)果表明，TRAP1 可通過(guò)減少ROS 產(chǎn)生而在保護(hù)線粒體免受破壞性刺激中起作用。

TRAP1 對(duì)心肌細(xì)胞也存在保護(hù)作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TRAP1 可通過(guò)阻斷TAK∕P38、JNK 和AKT 等信號(hào)通路來(lái)減輕由壓力負(fù)荷引起的心肌肥大和心肌纖維化［15］。低氧環(huán)境可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中TRAP1 的表達(dá)增加，且TRAP1 蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放對(duì)缺氧心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用［16］。VOLOBOUEVA 等［17］用不含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的TRAP1 表達(dá)量增高，同時(shí)TRAP1 的過(guò)表達(dá)可減少葡萄糖糖剝奪的星形膠質(zhì)細(xì)胞中ROS 的產(chǎn)生和維持細(xì)胞線粒體膜電位。本研究利用高糖處理H9c2 細(xì)胞，觀察到高糖環(huán)境下細(xì)胞中TRAP1 的表達(dá)量較正常糖對(duì)照組及高滲組均下降，高滲對(duì)照組排除了高糖環(huán)境下滲透壓升高的影響，提示高糖毒性可引起心肌細(xì)胞TRAP1 表達(dá)下降。同時(shí)，筆者觀察到高糖環(huán)境下ROS 表達(dá)量較正常糖環(huán)境下和高滲透壓環(huán)境下均有所增加。對(duì)細(xì)胞線粒體功能及細(xì)胞損傷的檢測(cè)顯示高糖環(huán)境下細(xì)胞線粒體膜電位降低，線粒體功能受損，細(xì)胞活性下降。提示高糖毒性可通過(guò)增加ROS 的產(chǎn)生，影響線粒體功能，進(jìn)而影響心肌細(xì)胞活性，造成心肌損傷。而TRAP1 表達(dá)的下降可增加細(xì)胞內(nèi)ROS 含量，從而影響細(xì)胞線粒體功能，可能與高糖環(huán)境下ROS所致的線粒體功能受損所致的心肌損傷密切相關(guān)。

綜上所述，高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞中TRAP1 蛋白表達(dá)的下降，參與到ROS 增加介導(dǎo)的心肌線粒體功能改變所致的糖尿病心肌病變中，但其中具體機(jī)制通路尚未明確，下一步需完善相關(guān)研究，為DCM 治療新方法提供理論依據(jù)。