丁苯酞預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注大鼠CHOP及Caspase-3的影響

高 蘭

鄭州市中心醫(yī)院，河南 鄭州 450000

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在再灌注細(xì)胞凋亡過程中至關(guān)重要[1-2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上跨膜蛋白肌醇依賴酶1(IRE1)作為ERS感受器具有重要調(diào)節(jié)作用，其可通過激活下游的凋亡信號(hào)分子CHOP，活化Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3-5]。近年來，藥物預(yù)處理已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[6]。丁苯酞能夠阻斷腦卒中多個(gè)病理環(huán)節(jié)，從而治療急性缺血性腦卒中。丁苯酞預(yù)處理能否提高神經(jīng)細(xì)胞對(duì)腦缺血的耐受性仍在初期研究階段。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)再灌注損傷中IRE1通路相關(guān)因子的檢測(cè)，為進(jìn)一步探討預(yù)防性藥物治療在降低缺血性腦卒中的發(fā)病率中的作用。

1 材料與方法

1．1動(dòng)物與分組健康雄性Wistar大鼠共72只，體質(zhì)量250～280 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成假手術(shù)組、缺血再灌注組、丁苯酞預(yù)處理組，各組分別在再灌注后6 h、12 h、24 h分為3個(gè)亞組，每組8只。各組按實(shí)驗(yàn)要求分別在不同時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行CHOP、Caspase-3免疫組化測(cè)定。

1．2主要試劑丁苯酞膠囊(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司提供)。兔抗鼠CHOP單克隆抗體、兔抗 Caspase-3 抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，SP免疫組化試劑盒、DAB染色劑試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)。

1．3方法將丁苯酞膠囊溶于生理鹽水配成10 mg/mL混懸液，使用前充分搖勻，以50 mg/(mg·d)的劑量術(shù)前灌胃5 d，其余2組相應(yīng)給予等體積生理鹽水。

1．4動(dòng)物模型的制備采用Zea Longa線法[7]制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注大鼠模型：首先10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠。取仰臥位固定后消毒，取頸部正中切口，鈍性深部分離頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，先結(jié)扎CCA和ECA，眼科剪在ECA剪一小口，并將消毒后的線栓插入ECA，后經(jīng)CCA分叉處進(jìn)入ICA，線拴插入深度(18.5±0.5)mm，稍感阻力時(shí)扎緊并固定線栓。缺血2 h后抽提線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組不插線拴，其余步驟同上。再灌注后在設(shè)計(jì)觀察時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物取腦，按Zea Longa 5分制進(jìn)行評(píng)分，1～3分的大鼠入實(shí)驗(yàn)組。

1．5 SP法免疫組織化學(xué)測(cè)定缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，依次生理鹽水、4%多聚甲醛溶液快速心臟灌注，內(nèi)固定后開顱取腦，選取視交叉前后2 mm的腦組織，多聚甲醛溶液4 ℃固定72 h，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋冠狀切片。片厚4 μm，其后用SP免疫組化法測(cè)定CHOP、Caspase-3表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野在高倍鏡10×40觀察拍照，顯微鏡下胞質(zhì)或胞核有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。

2 結(jié)果

2．1丁苯酞預(yù)處理對(duì)CHOP活性的影響假手術(shù)組腦組織內(nèi)CHOP的陽性細(xì)胞微量表達(dá)，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組CHOP陽性表達(dá)6 h時(shí)少量增加，12 h時(shí)表達(dá)逐漸升高，24 h時(shí)達(dá)峰。與模型組比較，丁苯酞預(yù)處理組可降低腦CHOP的表達(dá)(P<0.01)。見表1。

2．2丁苯酞預(yù)處理對(duì)Caspase-3的影響假手術(shù)組腦組織內(nèi)Caspase-3染色陽性細(xì)胞微量表達(dá)，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組Caspase-3陽性細(xì)胞變形且體積變小，其表達(dá)6 h少量增加，12 h進(jìn)一步升高，24 h明顯增加。與模型組比較，丁苯酞預(yù)處理在6 h、12 h時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但24 h時(shí)Caspase-3表達(dá)陽性染色細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠CHOP表達(dá)比較Table 1 Comparison of the expression of CHOP in each

注：與假手術(shù)組比較，△P<0.01；與缺血再灌注組比較，▲P<0.01

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)Caspase-3的表達(dá)Table 2 Caspase-3 expression on rats in each

注：與假手術(shù)組比較，△P<0.05；與缺血再灌注組比較，▲P<0.05

3 討論

腦缺血再灌注后鈣離子平衡失調(diào)、氧化應(yīng)激損傷等均會(huì)導(dǎo)致誤折疊蛋白的積累，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，生理功能發(fā)生紊亂[8-11]。LI等[12-13]研究顯示，通過減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以保護(hù)腦免受缺血再灌注損傷。誤折疊蛋白反應(yīng)(UPR)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡后發(fā)生的適應(yīng)性信號(hào)反應(yīng)，其作用是增加正確蛋白的合成并減少誤折疊蛋白負(fù)荷，從而恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞存活[14-16]。嚴(yán)重持續(xù)的ERS，適應(yīng)性的保護(hù)機(jī)制無法有效恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，UPR則轉(zhuǎn)化為促凋亡模式導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17-19]。UPR通路由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上3種跨膜蛋白R(shí)NA依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶樣激酶(PERK)、肌醇依賴酶 1(IRE1)和活化的轉(zhuǎn)錄因子 6(ATF6)作為ERS感受器執(zhí)行[20-22]。其中IRE1通路是UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)樞紐[23-25]。嚴(yán)重ERS時(shí)，激活的IRE1信號(hào)通路則啟動(dòng)凋亡程序，通過激活下游的凋亡信號(hào)分子CHOP介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26-27]。CHOP又稱DNA損傷基因，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子。CHOP缺陷則能保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡[28-31]。正常情況下CHOP表達(dá)很低，嚴(yán)重持久ERS，過度表達(dá)的CHOP通過抑制凋亡負(fù)調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2，或增加促凋亡死亡受體5蛋白的表達(dá)，進(jìn)而激活Caspase家族導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[32-35]。Caspase-3是凋亡的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者，在凋亡最后程序中起關(guān)鍵作用[36-38]。因此，抑制IRE1信號(hào)通路下游凋亡信號(hào)分子CHOP及作為凋亡執(zhí)行者的Caspase-3，對(duì)減輕再灌注損傷具有一定的意義。本實(shí)驗(yàn)顯示，與假手術(shù)組相比，缺血再灌注6 h時(shí)CHOP表達(dá)開始增加，再灌注12 h時(shí)繼續(xù)升高，24 h達(dá)峰；伴CHOP表達(dá)增多，在相對(duì)應(yīng)再灌注時(shí)間點(diǎn)Caspase-3表達(dá)也逐漸增加。表明再灌注模型不同時(shí)間點(diǎn)Caspase-3表達(dá)增加與CHOP表達(dá)增多密切相關(guān)。

藥物預(yù)處理是指在嚴(yán)重缺血之前給予的保護(hù)性干預(yù)措施。可能機(jī)制指通過藥物激發(fā)或模擬機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)，使腦組織在面臨預(yù)處理后更為嚴(yán)重的損傷時(shí)具有較強(qiáng)的抵抗力，是近年來關(guān)注的熱點(diǎn)問題。丁苯酞是中國第一個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國家類化學(xué)新藥[39]。可通過抑制血小板集聚、抗自由基、恢復(fù)能量代謝等多種藥理作用改善腦卒中后神經(jīng)功能缺損癥狀[40]。既往研究多側(cè)重于對(duì)缺血性腦血管病的治療，但丁苯酞預(yù)處理能否通過提高神經(jīng)細(xì)胞對(duì)腦缺血的耐受性仍在初期研究階段，具體機(jī)制還不清楚。

本實(shí)驗(yàn)觀察了丁苯酞預(yù)處理對(duì)凋亡信號(hào)分子CHOP及Caspase-3活性的影響，結(jié)果顯示，與模型組比較，丁苯酞預(yù)處理組在再灌注24 h時(shí)CHOP、Caspase-3表達(dá)明顯降低，表明丁苯酞預(yù)處理可能通過抑制IRE1通路轉(zhuǎn)錄因子CHOP，減少Caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致缺血再灌注損傷，為丁苯酞在預(yù)防性用藥、減少腦卒中發(fā)生及減輕神經(jīng)功能缺損等方面提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。