銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液對大鼠腦缺血/再灌注神經(jīng)保護(hù)作用的研究

劉新生 王 昆 李時(shí)光 李艾帆 張瑞鋒

鄭州市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450004

腦缺血/再灌注時(shí)會(huì)出現(xiàn)氧自由基釋放過度、炎癥反應(yīng)等，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[1-2]。當(dāng)氧自由基的產(chǎn)生遠(yuǎn)超過機(jī)體自身清除能力時(shí)，破壞細(xì)胞膜，損傷血管及神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞等，導(dǎo)致神經(jīng)功能損害。本實(shí)驗(yàn)通過對腦缺血/再灌注損傷的大鼠模型進(jìn)行研究，初步探討銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液對腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑SD大鼠(SPF級)，雄性，體質(zhì)量220～260 g，5月齡，由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)大鼠于屏障環(huán)境中，相對濕度50%～60%，溫度23～25 ℃，自由進(jìn)食水，5 d后開始實(shí)驗(yàn)。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)放免試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，其他試劑均為市售分析純。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號140204)。

1．2儀器高速臺(tái)式低溫離心機(jī)(德國Heraeus)，恒溫振蕩器(常州國華公司ZD-85)，電子分析天平(湘醫(yī)天平制造廠AEU-210)。

1．3方法

1．3．1 動(dòng)物分組及模型制備：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成3組：模型組、假手術(shù)組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺組，每組12只。所有動(dòng)物手術(shù)前1 d禁食水。實(shí)驗(yàn)組大鼠注射相應(yīng)濃度的藥物(經(jīng)尾靜脈)，模型組和假手術(shù)組用生理鹽水代替。

本實(shí)驗(yàn)采用Longa法[3]制備缺血性卒中大鼠模型。腹腔注射10%水合氯醛(320 mg/kg)麻醉大鼠，仰臥固定，頸部正中切開，依次分離皮下組織及肌肉，充分暴露切口處血管及神經(jīng)組織，游離頸部血管叢，處理頸外動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈作一切口，插入線栓，緩慢推進(jìn)至大腦中動(dòng)脈(約16 mm)，造成血管閉塞，后固定線栓，結(jié)扎，縫合，腦缺血模型形成；2 h后緩慢拔出線栓，實(shí)現(xiàn)大鼠缺血模型再灌注。假手術(shù)組只插入線栓、不阻斷大腦中動(dòng)脈。

1．3．2 大鼠行為學(xué)評分：造模后12 h、24 h、48 h、72 h，提鼠尾懸空，觀察前肢活動(dòng)；置于地面，觀察其行走情況，后推雙肩，觀察兩側(cè)抵抗力的差異。分?jǐn)?shù)越高，說明其神經(jīng)行為損傷越嚴(yán)重。見表1。

1．3．3 SOD、GSH和MDA含量測定：隨機(jī)取大鼠每組4只，斷頭，取適量腦組織加生理鹽水制成1%的勻漿液，離心(3 400 r/min) 9～10 min，取上清，用BCA蛋白試劑盒測蛋白濃度(按照試劑盒說明書進(jìn)行)。

1．3．4 組織學(xué)分析：隨機(jī)取大鼠每組6只，斷頭、取腦，10%中性福爾馬林液固定，按常規(guī)石蠟切片技術(shù)處理，切片后HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)。

1．3．5 大鼠NF-κB含量測定：隨機(jī)取各組大鼠適量腦組織，裂解成勻漿液，使用western blot方法測定NF-κB的含量。

2 結(jié)果

2．1實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)行為學(xué)影響模型組動(dòng)物提尾懸空時(shí)出現(xiàn)左前肢內(nèi)收等局灶性神經(jīng)行為損害癥狀。術(shù)后48 h、72 h評分：銀杏二萜內(nèi)酯葡胺組與模型組相比，行為評分有顯著性差異(P<0.01)。提示銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可改善腦缺血/再灌注模型大鼠的行為活動(dòng)能力。見表2。

2．2各組動(dòng)物生化測定結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組動(dòng)物較GSH及SOD含量顯著降低，MDA含量增加，提示缺血/再灌注損傷可至腦組織內(nèi)GSH、SOD以及MDA的含量發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的變化；與模型組相比，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺組SOD、GSH明顯提高，MDA明顯減少，提示該藥物可減輕腦組織中GSH、SOD以及MDA等物質(zhì)的改變。見表3。

2．3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物HE染色在光學(xué)顯微鏡下，假手術(shù)組動(dòng)物腦細(xì)胞整齊、形狀規(guī)則；模型組缺血灶腦細(xì)胞間隙增寬、胞體縮小、結(jié)構(gòu)模糊、胞質(zhì)不豐富、核仁不清晰。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺組較模型組的病理損害顯著減輕(圖1)。

表1 造模大鼠的行為學(xué)評分Table1 Behavioral scores of model rats

表2 腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分Table2 Neurological function scores in rats with cerebral ischemia

注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.05，與模型組比較，*P<0.01

表3 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺組動(dòng)物GSH、SOD及MDA的變化Table 3 Changes of GSH，SOD and MDA in ginkgo diterpene lactone glucuron

注：與假手術(shù)組比較，△P<0.01，△△P<0.05；與模型組比較，P<0.05，**P<0.01

圖1 HE染色(×400) A：假手術(shù)組；B：模型組；C：銀杏二萜內(nèi)酯葡胺組Figure 1 HE staining (×400) A：sham operation group；B：model group；C：ginkgo diterpene lactideglucamine group

2．4大鼠NF-κB含量測定結(jié)果假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)大鼠中NF-κB的表達(dá)(0.423±0.22)低于模型組(0.895±0.14)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組大鼠NF-κB的表達(dá)高于銀杏二萜內(nèi)酯葡胺組(0.786±0.14)，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

3 討論

顱內(nèi)組織由前循環(huán)(頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng))和后循環(huán)(椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng))雙重供血，前后循環(huán)由顱底動(dòng)脈環(huán)(willis環(huán))相連，對腦組織血液的調(diào)節(jié)和代償具有重要意義[4]。血氧、血糖、血尿酸、血脂、血同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)以及血液黏滯度和凝固性的改變和血液病理狀態(tài)(紅細(xì)胞增多癥、白血病、異常蛋白血癥、血小板增多癥等)，以及影響心輸出量的疾病如心律不齊、房室傳導(dǎo)阻滯、心肌損害，亦可使腦局部血流量突然減少成為腦組織一過性缺血的誘發(fā)因素。腦微動(dòng)脈在長期痙攣和高血壓的機(jī)械性沖擊的影響下，可發(fā)生纖維性壞死、管腔阻塞，其支配的腦組織可因血液供應(yīng)被暫時(shí)中斷而導(dǎo)致腦缺血發(fā)作[5-6]。

葡萄糖及酮體是腦組織利用的能量物質(zhì)，但腦組織本身不含糖原。當(dāng)腦部供血?jiǎng)用}出現(xiàn)阻塞而無側(cè)支開放代償時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的缺血病理生理反應(yīng)，腦細(xì)胞開始無氧糖酵解代謝途徑，乳酸堆積，形成細(xì)胞乳酸酸中毒，進(jìn)一步影響線粒體膜呼吸鏈，ATP合成減少，Na-K-ATP酶失活，細(xì)胞離子失衡及水分潴留；SOD及GSH活性降低，MDA含量升高，線粒體膜電位降低，Ca2+內(nèi)流，膜通透性增加，并釋放相應(yīng)的凋亡及炎性因子，引發(fā)細(xì)胞損害。隨著缺血缺氧時(shí)間延長，受損的腦細(xì)胞內(nèi)氧自由基及脂質(zhì)過氧化物不斷堆積，損傷膜結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞完整性，釋放大量溶解酶，導(dǎo)致腦組織破壞溶解[7-10]。腦內(nèi)微血管壞死，血管通透性增大，血腦屏障功能進(jìn)一步破壞，發(fā)生血管性腦水腫，加重腦細(xì)胞損傷，梗死進(jìn)展。另有研究顯示，腦缺血時(shí)NF-κB活化，加速腦細(xì)胞死亡，若采用降低其活性的措施則可縮小腦梗死體積[11-14]。腦組織的能量代謝的變化，會(huì)引起過度炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響腦部血流供應(yīng)，還會(huì)直接破壞組織結(jié)構(gòu)。而腫瘤壞死因子及白介素-6等炎性介質(zhì)的釋放會(huì)進(jìn)一步加重血腦屏障的破壞，從而使缺血損傷放大，加重神經(jīng)功能的損傷。

研究顯示，銀杏提取物有效成分主要是黃酮和內(nèi)酯，具有改善微循環(huán)、抗氧化、抑制血小板聚集、降血脂、抗衰老、保護(hù)血管內(nèi)皮、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶等作用[15-20]。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺以銀杏葉為原料，經(jīng)提取純化后得到其有效部分銀杏二萜內(nèi)酯(銀杏內(nèi)酯A、B、K等)，輔料為葡甲胺、檸檬酸、氯化鈉[21-23]。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液適用于中風(fēng)病中經(jīng)絡(luò)恢復(fù)期痰瘀阻絡(luò)證，具有活血通絡(luò)之功效，癥見瘀血阻絡(luò)引起的胸痹心痛、中風(fēng)、半身不遂、舌強(qiáng)語蹇、冠心病穩(wěn)定型心絞痛、腦梗死等上述癥候者[24-28]。

本研究表明，與對照組相比，腦缺血再灌注模型組大鼠腦組織中SOD、GSH含量降低，MDA含量升高，NF-κB含量升高，腦組織HE染色觀察腦組織損害明顯；銀杏二萜內(nèi)酯葡胺組大鼠腦組織中存在類似改變，但與模型組比較，該組大鼠腦組織中SOD、GSH含量升高，MDA含量降低，NF-κB含量降低，且腦組織HE染色觀察腦組織損害較模型組明顯減輕；顯示了銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液能降低NF-κB活性，提高SOD、GSH，降低MDA含量，改善氧化應(yīng)激對神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，降低腦組織的損害，對腦缺血再灌注起到保護(hù)作用，從而降低神經(jīng)損害評分，與其他研究[42-45]一致。

本實(shí)驗(yàn)觀察到銀杏二萜內(nèi)酯葡胺通過抑制氧化損傷和炎性反應(yīng)來減少氧化損傷和神經(jīng)元缺失，說明其具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。