人外周血淋巴細胞染色體制備中的影響因素分析

楊夢迪 王如剛

人外周血淋巴細胞染色體畸變檢測是放射工作人員職業(yè)健康體檢的重要檢查項目，不僅能早期發(fā)現(xiàn)輻射效應(yīng)，而且還能對受照個體進行生物劑量估算[1]。染色體畸變分析被譽為電離輻射致人體損傷程度判斷的“金牌指標(biāo)”[2]，能否成功制備出供核型分析的染色體片是關(guān)鍵，但每個實驗室條件和實驗員操作手法不盡相同，因此總結(jié)出一套適合本單位實驗室條件的制備方法尤為重要。由于該技術(shù)要求細胞培養(yǎng)時間較長，因而易受培養(yǎng)時間、植物凝血素(phytohemagglutinin，PHA)濃度、秋水仙素(colchicne)濃度、滴片等影響而導(dǎo)致實驗失敗?，F(xiàn)對1 089 例人外周血染色體制備后的 4 356張染色體的標(biāo)本進行觀察記錄并總結(jié)分析，結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1對象 2016年2月-2017年7月參加職業(yè)健康體檢的放射作業(yè)人員1 089例。其中男性621名，女性468名，年齡21～65歲。

1.2儀器與試劑 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、離心機、顯微鏡。RPMI1640培養(yǎng)液(含20%小牛血清及PHA，青島萊佛生物工程研究所制備，產(chǎn)品備案號：魯青械備20160093)、肝素抗凝管、0.075 mol/L氯化鉀(KCL)、10 μg/mL秋水仙素(終濃度0.04 μg/mL，青島萊佛生物工程研究所制備)、甲醇、冰醋酸、吉姆薩(Giemsa)染色液。

1.3外周血淋巴細胞染色體標(biāo)本制備質(zhì)量控制 根據(jù)王喜愛等[3]的研究結(jié)論，將制作效果分為 6 級：A級，淋巴細胞數(shù)量多，分布均勻、密度適中; 染色清晰、胞漿完整、體漿分明、透明度好; 能有效提高染色體畸變的檢出率和閱片效率。B級，淋巴細胞數(shù)量少，分布不均、密度稀疏; 其他與 A 級相同。C級，淋巴細胞數(shù)量多，分布均勻、密度適中; 染色清晰、胞漿較厚、染色體粘連在一塊、透明度模糊; 較能有效提高染色體畸變的檢出率和閱片效率。D 級淋巴細胞數(shù)量特多，分布成團狀、密度過密; 染色清晰、染色體粘連在一塊、胞漿較厚、透明度模糊; 不能有效提高染色體畸變的檢出率和閱片效率。E 級淋巴細胞數(shù)量少，分布成不均、密度稀疏; 染色清晰、體漿分離， 染色體單個分散、透明度模糊; 不能有效提高染色體畸變的檢出率和閱片效率。F 級淋巴細胞數(shù)量特多，分布成團狀、密度過密; 染色清晰、染色體粘連在一塊。

1.4方法 按照常規(guī)人外周血全血培養(yǎng)與染色體制備技術(shù)的基本操作要點，采用微量全血培養(yǎng)法制片[4]，每人接種2瓶，每例滴片2張(滴片：根據(jù)細胞濃度加入適量的固定液，混勻，滴在濕冷的載玻片上3-4滴，氣干法制片),Giemsa染色，顯微鏡高倍鏡(10×40倍)、油鏡(10×100倍)鏡檢100個染色體數(shù)目為46±1，染色體分散良好，長短適中，形態(tài)清晰的中期細胞[5]，計數(shù)染色體畸變細胞數(shù)，計算畸變率，結(jié)果經(jīng)2人復(fù)核后確認(rèn)。

1.5外周血淋巴細胞染色體標(biāo)本制備 在無菌條件下，將800 μL肝素抗凝全血接種于1 640培養(yǎng)液中，充分混勻后置37 ℃培養(yǎng)箱放置48～56 h。收獲前5 h加入秋水仙素,終濃度0.04 μg/mL。常規(guī)收獲，制片，吉姆薩染色(表1)。

表1 人外周血淋巴細胞染色體操作要點

2 結(jié)果

2.1成功率 1 089例放射工作人員外周血淋巴細胞染色體標(biāo)本中，1次檢測成功1 077例，另有12例檢測未能完成，經(jīng)采取補救措施檢測成功，成功率100%。常規(guī)人外周血全血培養(yǎng)與染色體制備技術(shù)能夠保證絕大部分實驗結(jié)果和對失敗的原因分析和處理方式正確。

2.2影響標(biāo)本質(zhì)量的原因及其應(yīng)對措施 鏡下核型分析結(jié)果顯示，12例檢測失敗的樣本中主要表現(xiàn)為分裂相少、染色體分散及形態(tài)差等，其影響因素主要為培養(yǎng)時間、低滲、秋水仙素作用時間等(表 2)。

表2 影響標(biāo)本質(zhì)量的原因及應(yīng)對措施

2.3質(zhì)量較差的樣本鏡下核型分析結(jié)果 由于培養(yǎng)時間短或受檢者年齡偏大導(dǎo)致分裂相少；秋水仙素作用時間長導(dǎo)致染色體形態(tài)短粗；低滲液打散不充分導(dǎo)致細胞帶胞漿，染色體分散差；以及菌落數(shù)增多(圖1，2)。

注：A為分裂相較少；B為染色體形態(tài)較為粗短；C為細胞帶胞漿，染色體分散差；D為細菌的菌落數(shù)較多。圖1 質(zhì)量較差的核型分析結(jié)果

注：A為顯微鏡高倍鏡(10×40倍)；B為油鏡(10×100倍)。圖2 正常核型分析結(jié)果

3 討論

3.1細胞增殖周期隨年齡增長而延長[6]，淋巴細胞對PHA刺激的反應(yīng)性減弱，細胞培養(yǎng)的時間需要適當(dāng)延長。由于中老年人的淋巴細胞分裂周期比青年后延，導(dǎo)致分裂相不多，因此，年齡每增加10歲，培養(yǎng)時間可以從48 h再延長1 h收獲[2]。如用真空采血管采血，必須選用肝素抗凝管，其他抗凝劑會導(dǎo)致細胞死亡。

3.2PHA是常用的從菜豆中提取的淋巴細胞有絲分裂原，其中所含粘多糖有刺激淋巴細胞分裂的作用，能促使處于間期(G0)的淋巴細胞轉(zhuǎn)化為原淋巴細胞，重新進入增殖周期進行有絲分裂；在PHA的作用下，大多數(shù)淋巴細胞處于生長活躍期，在培養(yǎng)終止前數(shù)小時，加入適量秋水仙素，可使細胞分裂停止在最適于觀察染色體形態(tài)的分裂中期。細胞只有在PHA的作用下才能進入有絲分裂，只要充分混勻，使淋巴細胞都能充分接觸到PHA，細胞即可正常分裂。

3.3低滲過程也是染色體制備中的重要環(huán)節(jié)，加入低滲液后，應(yīng)立即吹打，沖散細胞團塊，用力輕柔，避免細胞破碎。低滲時間一般控制在15～20 min，當(dāng)?shù)蜐B處理時間過長時，可引起細胞膜破碎，導(dǎo)致染色體丟失；低滲處理時間不足時，細胞膨脹不夠，則染色體分散不佳，呈團狀，難以進行染色體計數(shù)分析[7]。經(jīng)過低滲處理的細胞因已膨脹，容易過早破裂，造成分裂細胞丟失，所以低滲后操作應(yīng)注意力度一定要輕。低滲處理適當(dāng)，所得染色體輪廓清晰，利于染色。

3.4收獲細胞前所有步驟都要保證無菌操作，防止細菌和病毒的污染。體外培養(yǎng)的細胞由于缺乏機體的免疫等機制從而失去對微生物的防御能力，若發(fā)生細菌等微生物的污染，將會導(dǎo)致細胞死亡，因此接種時一定要在生物安全柜中操作，使用無菌注射器接種時，要用酒精消毒培養(yǎng)瓶的瓶塞。

3.5秋水仙素一方面能阻止微管 (紡錘絲) 形成，或使已形成的微管解聚；另一方面，秋水仙素的作用又能促使DNA的復(fù)制和有關(guān)蛋白質(zhì)合成[8]，可使細胞分裂停止在最適于觀察染色體形態(tài)的分裂中期，還可使染色體縮短變粗，便于觀察。秋水仙素的濃度越高，作用時間越長，染色體形態(tài)越短粗，因此，在血細胞培養(yǎng)時，加入秋水仙素的劑量及處理時間與中期分裂相的多少和染色體長短有密切的關(guān)系。為了獲得適宜的染色體形態(tài)，需要嚴(yán)格控制秋水仙素的濃度和作用時間[9]。

3.6滴片的距離、滴加量多少、制片的方式都會影響染色體分期效果[10]。選用病理級玻片，冰凍4 h以上，即為冰片，如果冷凍不夠，細胞難以貼附在玻片上，會影響染色體分散效果。滴片時，先用吸管吸取少量細胞懸液以20～30 cm高的距離滴在玻片上，每片3～4滴，然后在酒精燈外焰過火，最后在空氣中繼續(xù)晾干[11]。滴片后加熱溫度不足,細胞帶包漿，染色體分散差；滴片后加熱時間太長、溫度太高，可導(dǎo)致染色體形態(tài)發(fā)毛，不清晰，分裂相不完整，染色體散在。

輻射誘發(fā)染色體畸變，即對輻射的高度敏感性和誘發(fā)染色體非穩(wěn)定性畸變的特異性和畸變在體內(nèi)保存時間的相對持續(xù)性，以及染色體畸變與某些腫瘤和遺傳性疾病的相關(guān)性，將染色體畸變作為評估受小劑量照射人群輻射損傷的首選指標(biāo)[12]。在外周血淋巴細胞染色體制備過程中，影響標(biāo)本制備的因素有很多，實驗人員需具備豐富的操作經(jīng)驗，不能輕視每一個步驟，才能保證染色體標(biāo)本制備的成功率。