艾灸對(duì)胃荷瘤大鼠瘤體增長的抑制作用＊

譚 靜，陽仁達(dá)，趙 歡，彭卓雋，歐陽里知，林亞平

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 長沙 410208）

胃癌（gastric carcinoma）是指源于胃粘膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，常以上腹部不適、疼痛、嘔吐等為主要癥狀。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)最新統(tǒng)計(jì)，胃癌的發(fā)病率、死亡率分別位于惡性腫瘤的第5 位、第3 位，70%以上的新發(fā)病例集中在中國在內(nèi)的發(fā)展中國家[1]。因此，胃癌的防治工作仍然是我國亟待解決的公共衛(wèi)生問題。目前胃癌的治療已形成手術(shù)、放化療為主，免疫治療、熱療為輔的治療模式。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的科學(xué)內(nèi)涵不斷被揭示。艾灸作為中醫(yī)學(xué)的重要組成，通過綜合熱效應(yīng)激活體內(nèi)經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)誘導(dǎo)各種復(fù)雜的反饋響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的防治，素有“保命之法，灼艾第一”的美譽(yù)。研究表明，艾灸已積極運(yùn)用于各類惡性腫瘤患者生存質(zhì)量的控制管理中[2-4]。我們的前期研究表明[5]：艾灸后，胃荷瘤大鼠外周血中的自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷性T 細(xì)胞均被激活。但艾灸對(duì)瘤體生長的抑制作用尚不明確，為此，進(jìn)行了以下探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠6 只，雄性，160-180 g，用于瘤組織制備；SPF 級(jí)SD 大鼠50 只，雌雄各半，200-240 g，用于分組實(shí)驗(yàn)。上述動(dòng)物購自中國食品藥品檢定研究院動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2014-0013，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（京）2014-0003。實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院動(dòng)物SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。飼養(yǎng)環(huán)境為12 h 晝夜節(jié)律交替，室溫25 ±5℃，相對(duì)濕度50%-70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處理均遵照、符合有關(guān)的倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

Walker-256 細(xì)胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院饋贈(zèng)）；PCNA 抗體（美國BOSTER）；TUNEL 試劑盒（江蘇凱基）；直徑0.7 cm 艾條（長沙艾醫(yī)生物）；戊巴比妥鈉（上海化學(xué)試劑廠）；6002B型紅外線治療儀（徐州天飛有限公司）；數(shù)顯表面測(cè)溫儀（浙江波仕歐）；數(shù)顯游標(biāo)卡尺（500-151-30，日本三豐）；切片機(jī)（RM2016，上海徠卡）；攤片機(jī)（KD-P，浙江科迪）；脫水機(jī)（JJ-12J，武漢俊杰）；包埋機(jī)（JB-P5，武漢俊杰）；鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9053A，上海一恒）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9162，上海一恒）；顯微鏡（DM500，德國Leica）。

1.3 模型建立方法

參考文獻(xiàn)[6,7]，模型建立主要包括腹水瘤制備、皮下瘤組織制備、手術(shù)移植三個(gè)過程。腹水瘤制備：將3只體重160-180 g 大鼠分別腹腔注射0.3 mL Walker-256細(xì)胞的懸液（2×107個(gè)·mL-1）。皮下實(shí)體瘤組織制備：腹腔注射7 d 后，待明顯腹水時(shí)處死動(dòng)物，收集腹水中Walker-256 細(xì)胞，調(diào)整至0.5 × 107個(gè)·mL-1，皮下注射于3 只160-180 g 的大鼠右前、右后肢，每個(gè)部位0.2 mL。手術(shù)移植：皮下注射7 d 后，待注射處形成大小約1.5 × 1.5 × 1 cm3的皮下實(shí)體瘤后，處死動(dòng)物，切開瘤體，取大小約0.8 × 0.8 × 0.5 cm3新鮮魚肉樣瘤組織通過手術(shù)移植于體質(zhì)量200-240 g 大鼠胃大彎皮區(qū)、腺區(qū)交界處的胃壁上。7 d后剖腹探查判斷造模是否成功。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：原種移植處形成體積0.5 cm3以上的瘤體，表面光滑，邊界清晰，無粘連及臟器侵犯，組織學(xué)證實(shí)與皮下實(shí)體瘤同源（圖1）。

圖1 皮下實(shí)體瘤（左）、胃部瘤體（右）HE染色觀察（×400倍）

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及治療

分組方法：實(shí)驗(yàn)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、艾灸組及紅外組5 組。采用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)。手術(shù)模擬皮下實(shí)體瘤組織胃壁移植過程，成功后，隨機(jī)分入假手術(shù)組；通過1.3 中所述方法制備胃荷瘤動(dòng)物模型，成功后，隨機(jī)分入模型組、艾灸組及紅外組。每組動(dòng)物10只，雌雄各半，共計(jì)50只動(dòng)物。

治療方法：造模成功的第2 d，艾灸組參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]中有關(guān)大鼠穴位定位方法，仰臥位固定施灸中脘、關(guān)元、足三里（雙），隔日俯臥位固定施灸脾俞（雙）、胃俞（雙）。施灸時(shí)，將直徑為7 mm 艾條固定在自制艾灸架上于穴位垂直上方點(diǎn)燃。利用表面測(cè)溫儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)表皮溫度，適時(shí)去除艾灰、調(diào)整施灸高度，確保表皮溫度持續(xù)在42±1℃之間。每次施灸20 min，1 日1 次，連續(xù)21 d。紅外組于造模成功后第2 d，使用波長0.4-3 μm.的短波紅外線照射，強(qiáng)度1 檔、輸出功率10W、光斑直徑3 cm，隔日交替照射胃脘部及背部T11 至T13 區(qū)域，治療時(shí)溫度的控制及要求、治療時(shí)間、頻次、療程同艾灸組?？瞻?、假手術(shù)、模型組動(dòng)物在同一時(shí)間段，隔日仰臥、俯臥交替捆綁束縛。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 生存狀態(tài)積分評(píng)定

正常大鼠，活動(dòng)自如，毛色光亮（5 分）；呼吸平穩(wěn)，對(duì)外界刺激反應(yīng)較敏銳，能站立行走，但步態(tài)較緩慢，毛色較光亮（4 分）；意識(shí)清醒，但不能四肢站立行走，可自主爬行，部分鼠毛脫落，毛質(zhì)較粗糙、發(fā)黃（3分）；嗜睡，反應(yīng)遲鈍、呼吸較急促、淺快，呼吸動(dòng)度可，較多鼠毛脫落，毛質(zhì)較粗糙、背毛聳立明顯（2分）；昏迷、靜臥不動(dòng)，只有微弱的腹式呼吸運(yùn)動(dòng)（淺慢），或明顯節(jié)律紊亂、對(duì)外界刺激無明顯反應(yīng)，或極度遲鈍、被毛聳立（1分）；死亡（0分）。

1.5.2 腫瘤生長抑制率

動(dòng)物處死后，無菌環(huán)境下剖開腹腔，手術(shù)線結(jié)扎大鼠幽門部和賁門部，在兩結(jié)扎線之間剪下全胃，PBS溶液輕柔沖洗，無菌紗布吸干多余水分后將胃平攤于定型濾紙，暴露腫瘤部位，用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量胃部瘤體的最長徑（a），最小徑（b），根據(jù)公式V =（π/6）×[（a+b）/2]3，計(jì)算出腫瘤的體積。另可根據(jù)以下公式，計(jì)算腫瘤生長抑制率。

1.5.3 腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察

取腫瘤組織，4%低聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片。蘇木精-伊紅（HE）染色，普通光鏡下觀察腫瘤組織壞死，血管等情況。

1.5.4 免疫組化法檢測(cè)PCNA的表達(dá)

具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明的要求進(jìn)行，石蠟切片用微波修復(fù)抗原。PCNA 一抗稀釋度1∶50，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染。PCNA 陽性細(xì)胞胞核呈棕黃色。采用北航醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)于400倍鏡下采集各組腫瘤組織內(nèi)3個(gè)視野的圖像，分析其陽性目標(biāo)數(shù)密度。

1.5.5 TUNEL 法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡

按照試劑盒說明進(jìn)行對(duì)標(biāo)本的固定、封閉、陽性制片、連接、標(biāo)記、顯色、復(fù)染操作。制片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。凋亡細(xì)胞的陽性反應(yīng)物質(zhì)位于細(xì)胞核內(nèi),顏色為棕黃色。采用北航醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)于400 倍鏡下采集每個(gè)樣本3 個(gè)視野的圖像，分析記錄陽性細(xì)胞數(shù)密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。所有數(shù)據(jù)資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。滿足正態(tài)性時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊時(shí)用LSD 法檢驗(yàn)，不齊時(shí)用Dunnett T3 法檢驗(yàn)。不滿足正態(tài)性時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05定義差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 各組大鼠大鼠生存狀態(tài)積分比較（）

圖3 各組大鼠胃瘤體體積比較（±s）

2 結(jié)果

2.1 艾灸對(duì)荷瘤大鼠生存狀態(tài)的影響

在觀察時(shí)間內(nèi)，各組均未見動(dòng)物死亡。由圖2 可知：與空白組比較，模型組成模后第5 d 起生存狀態(tài)持續(xù)變差（P＜0.01）；干預(yù)15 d 后，與模型組比較，艾灸組、紅外組動(dòng)物生存狀態(tài)改善，積分值增加（P＜0.01，P＜0.05），且艾灸組動(dòng)物的狀態(tài)優(yōu)于紅外組（P＜0.05）；干預(yù)20 d 后，艾灸組動(dòng)物的生存狀態(tài)積分與空白組比較已無差異（P＞0.05）。

2.2 艾灸對(duì)荷瘤大鼠腫瘤體積及轉(zhuǎn)移的影響

干預(yù)期間內(nèi)無動(dòng)物死亡。干預(yù)結(jié)束處死動(dòng)物、開腹探查后發(fā)現(xiàn)模型組、艾灸組、紅外組均有瘤體破潰消失，其中模型組1只，艾灸組6只、紅外組3只。如圖3所示，剩余動(dòng)物瘤體體積組間出現(xiàn)差異，表現(xiàn)為艾灸組、紅外組瘤體體積明顯小于模型組（P＜0.01，P＜0.05），但艾灸、紅外組組間無差異（P＞0.05）。經(jīng)計(jì)算，艾灸組、紅外組的腫瘤生長抑制率分別為41.89%、28.09%。另外，各組均有腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其中模型組4例，艾灸組1 例、紅外組6 例，轉(zhuǎn)移部位以腹水及脾臟最多（表1）。

表1 各組腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況

2.3 艾灸對(duì)荷瘤大鼠瘤體形態(tài)學(xué)觀察（HE）

如圖4所示，模型組瘤體內(nèi)出現(xiàn)大量增生的血管，血管壁較厚，較少有壞死灶；艾灸組瘤體內(nèi)出現(xiàn)大量壞死灶，血管較少；紅外組瘤體內(nèi)盡管出現(xiàn)了一定量壞死灶，但也有大量血管增生，且血管壁較薄。

2.4 艾灸對(duì)荷瘤大鼠腫瘤細(xì)胞增殖的影響

如圖5-圖6 所示，模型組內(nèi)腫瘤細(xì)胞PCNA 呈強(qiáng)陽性表達(dá)，艾灸組內(nèi)呈弱陽性表達(dá)，紅外組內(nèi)呈較強(qiáng)陽性表達(dá)。與模型組比較，艾灸組、紅外組陽性細(xì)胞數(shù)密度明顯減少（P＜0.01，P＜0.05），其中，艾灸組比紅外組減少更明顯（P＜0.05）。

圖4 各組腫瘤組織形態(tài)學(xué)×400倍

圖5 PCNA法檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞增殖×400倍

圖6 PCNA法檢測(cè)各組每平方毫米內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)密度（±s）

圖7 Tuenl法檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞凋亡×400倍

圖8 TUENL法檢測(cè)各組每平方毫米內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)密度（±s）

2.5 艾灸對(duì)荷瘤大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

如圖7-圖8所示，Tunel法測(cè)定模型組瘤體內(nèi)呈弱陽性表達(dá)，艾灸組內(nèi)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，紅外組內(nèi)呈較強(qiáng)陽性表達(dá)。與模型組比較，艾灸組、紅外組陽性細(xì)胞數(shù)密度明顯增加（P＜0.01，P＜0.05），其中，艾灸組比紅外組增加更明顯（P＜0.05）。

3 討論

惡性腫瘤是威脅人類健康及社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大公共健康問題。盡管其診斷已相對(duì)成熟，但其治療效果仍不理想，復(fù)發(fā)、病死率居高不下。手術(shù)、放化療作為常規(guī)抗瘤方法，其弊端日益凸顯：①非所有惡性腫瘤都符合手術(shù)指征；②放化療帶來副作用嚴(yán)重降低了患者的生存質(zhì)量，削弱了治療的依從性。由于腫瘤組織內(nèi)血管豐富，較正常組織更易吸收能量而升溫。研究表明[9-10]，腫瘤組織內(nèi)溫度升高至40℃以上后，細(xì)胞膜的流動(dòng)性及通透性增加，酶失活、代謝抑制、DNA合成受阻，腫瘤細(xì)胞將程序化死亡；另外，升溫將加劇血管內(nèi)瘀阻，導(dǎo)致血管破裂、瘤體破潰；再者，熱刺激介導(dǎo)熱應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)熱休克蛋白等物質(zhì)合成釋放，，促進(jìn)抗體、抗原結(jié)合，阻止抗原抗體復(fù)合物脫落，激活T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷[11,12]。基于此，臨床多采用紅外線、高頻電磁波等對(duì)全身或局部加熱以抗腫瘤。目前，熱療已成為臨床第五大抗腫瘤療法[13]。

艾灸作為中國傳統(tǒng)療法的重要組成，幾千年來為保障民生健康做出了重要貢獻(xiàn)。古人曾用“保命之法，灼艾第一”、“藥之不及，針之不到，必須灸之”高度贊揚(yáng)了艾灸對(duì)重癥治療的重要意義。中醫(yī)認(rèn)為，艾灸的溫補(bǔ)、溫通作用能有效針對(duì)腫瘤的“虛”、“寒”、“痰”、“瘀”、“毒”進(jìn)行治療。目前，艾灸已廣泛應(yīng)用于腫瘤患者各項(xiàng)癥狀的控制與管理當(dāng)中，主要體現(xiàn)在減少放化療的副作用，增加攝食及免疫力，調(diào)節(jié)情緒等方面[14-16]，對(duì)艾灸直接的腫瘤抑制作用觀察較少?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，艾灸主要通過灸熱刺激，興奮穴位中的感受器，其介導(dǎo)的復(fù)雜中樞響應(yīng)，誘發(fā)對(duì)神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多個(gè)系統(tǒng)對(duì)綜合調(diào)節(jié)。與單一的紅外線照射治療相比，艾灸釋放出波長600 nm 左右的紅光、2 500 nm 的中長波紅外線等綜合光線，穿透深度可達(dá)皮下1 cm 以上的深層組織，為機(jī)體的細(xì)胞代謝活動(dòng)和免疫功能提供必要的能量[17-19]。由于艾灸時(shí)光線的譜形、強(qiáng)度、峰值在整個(gè)施治過程中都在一定范圍內(nèi)不斷變化，很好地避免了溫度感受器的耐受[17]。本實(shí)驗(yàn)中采用懸灸（溫和灸）進(jìn)行治療，這是臨床艾灸最常使用的施灸方法。施灸時(shí)，控制表皮溫度在42℃左右，動(dòng)物肛溫在灸后8 min 時(shí)上升至40℃并穩(wěn)定。這種溫度既不會(huì)灼傷表皮，也能誘導(dǎo)熱應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生。施灸過程中，荷瘤動(dòng)物確無明顯的掙扎、撕叫等其他應(yīng)激反應(yīng)。

穴位的選擇是確保艾灸療效的關(guān)鍵因素之一。本研究中，通過詳細(xì)研究胃癌發(fā)生的病因病機(jī)，確定扶正固本、溫通經(jīng)絡(luò)、散瘀消滯為主要治則，結(jié)合對(duì)現(xiàn)有胃癌臨床治療針灸選穴規(guī)律的數(shù)字挖掘，確定施灸穴位為脾俞、胃俞、中脘、關(guān)元、足三里。選穴局部取穴、遠(yuǎn)端取穴結(jié)合辯證取穴，局部以胃募穴——中脘以理氣行滯，健脾和胃，提高荷瘤部位溫度；遠(yuǎn)端以胃之下合穴——足三里健脾益氣、祛濕化痰，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。選穴抓住“以虛為本”的主要病機(jī)，施灸關(guān)元以溫腎陽、壯真火，補(bǔ)元?dú)庵皇┚钠⒂?、胃俞補(bǔ)臟腑之氣，調(diào)和陰陽之氣機(jī)升降，促進(jìn)納運(yùn)。前后穴位交替施灸保證了穴位對(duì)灸熱刺激的敏感。實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)造模后，荷瘤動(dòng)物食量、體質(zhì)量、活動(dòng)量顯著下降，大便稀，體現(xiàn)出中醫(yī)“陽虛”、“氣虛”之證。施灸后，瘤鼠上述異常得以改善。前期研究我們發(fā)現(xiàn)，艾灸能激活瘤鼠體內(nèi)自然殺傷細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)大量熱應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)，但對(duì)腫瘤的抑制作用沒有詳細(xì)觀察。本研究結(jié)果證實(shí)艾灸能一定程度減少腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，瘤組織壞死灶增加、血管生成減少，瘤體增長被抑制。這些提示艾灸或具有直接抗癌作用，但是否與前期研究有關(guān)，具體機(jī)制如何均具有待進(jìn)一步研究。