酸性礦業(yè)廢水污染農(nóng)田土壤剖面孔隙水中N、S轉(zhuǎn)化功能基因豐度變化及其影響因素

徐欣如，查建軍，張明珠，孫慶業(yè)

(安徽大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230601)

【研究意義】氮循環(huán)是N2、無機(jī)氮化合物、有機(jī)氮化合物在自然界中相互轉(zhuǎn)化過程的總稱，是重要的微生物化能過程，包括氨化、硝化、反硝化、固氮作用等[1]。由于氮轉(zhuǎn)化過程涉及農(nóng)田氮肥有效性、水體富營(yíng)養(yǎng)化等，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在氮循環(huán)方面進(jìn)行了廣泛的研究。土壤中的硫主要以硫酸鹽形式存在，硫酸鹽的還原過程在土壤硫循環(huán)中占據(jù)位置，其主要執(zhí)行者為硫酸鹽還原菌[2]。因此研究土壤中氮硫轉(zhuǎn)化功能基因及其與土壤元素循環(huán)過程的關(guān)系具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，環(huán)境介質(zhì)中參與氮、硫轉(zhuǎn)化的功能微生物及其攜帶的基因受到了廣泛的關(guān)注。研究表明，反硝化菌與厭氧氨氧化菌之間存在協(xié)同和競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[3]，土壤層次的變化能夠影響氨氧化的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度[4]，C/N比大于6時(shí)，可限制上覆水中功能基因amoA-AOA的生長(zhǎng)，抑制氨氧化過程的進(jìn)行[5]，硫酸鹽含量會(huì)影響硫酸鹽還原過程[6]。作為一種環(huán)境介質(zhì)，多種元素的轉(zhuǎn)化過程在土壤中同時(shí)進(jìn)行，且不同元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程相互聯(lián)系、相互影響，如硫酸鹽還原過程能夠促進(jìn)固氮過程、其產(chǎn)物能夠抑制氨氧化過程[7]。土壤是固、氣和液三相統(tǒng)一體，土壤中參與氮、硫循環(huán)的微生物除附著于土壤顆粒外，還有一部分生活于土壤的孔隙水中。目前，關(guān)于土壤中參與氮硫循環(huán)微生物的研究多以土壤整體作為研究對(duì)象[8-9]，而關(guān)于土壤孔隙水的研究多集中于孔隙水中的污染物質(zhì)和理化指標(biāo)分析[10]，對(duì)于土壤顆粒和懸浮于孔隙水中微生物的變化以及與孔隙水理化性質(zhì)的關(guān)系還缺乏深入研究，土壤孔隙水的理化性質(zhì)與參與氮硫轉(zhuǎn)化功能基因豐度之間關(guān)系的研究相對(duì)較少。酸性礦業(yè)廢水是含硫化物的礦物與水、氧氣、微生物相互作用產(chǎn)生的，它們是礦山環(huán)境污染的重要來源[11]。酸性礦業(yè)廢水的典型特點(diǎn)是低pH、高硫酸鹽含量，以及含有大量的污染性金屬離子[12]，這些廢水不僅會(huì)造成地表和地下水污染，還會(huì)導(dǎo)致周邊土壤質(zhì)量退化，影響農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)[13]。目前針對(duì)酸性礦業(yè)廢水污染土壤的研究側(cè)重于重金屬污染，而忽略了對(duì)土壤中微生物群落以及功能基因的影響。銅陵是我國(guó)有色金屬基地之一，伴隨礦產(chǎn)資源開采形成了大量的酸性礦業(yè)廢水。這些酸性礦業(yè)廢水通過不同的途徑進(jìn)入周圍農(nóng)田，并隨著土壤孔隙水向下滲透進(jìn)入深層土壤，從而對(duì)土壤造成污染?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以安徽省銅陵市某處受酸性礦業(yè)廢水污染的農(nóng)田作為研究對(duì)象，基于熒光定量PCR技術(shù)分析了土壤剖面不同深度孔隙水中某些參與N、S轉(zhuǎn)化的功能基因的豐度，闡明受污染農(nóng)田土壤孔隙水中影響參與氮硫轉(zhuǎn)化的微生物功能基因豐度的主要因子，【擬解決的關(guān)鍵問題】為揭示酸性礦業(yè)廢水污染農(nóng)田土壤中的氮硫循環(huán)過程以及酸性礦業(yè)廢水污染農(nóng)田土壤生態(tài)修復(fù)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于安徽省銅陵市某礦區(qū)附近(30°50′～30°58′ N，117°50′～118°10′ E)，為亞熱帶氣候，無霜期有237～258 d，全年平均氣溫16.2 ℃，平均濕度在75 %～81 %之間，年均降雨量1346 mm，雨季集中在7-9月份[14]。所研究區(qū)域農(nóng)田由于長(zhǎng)期受酸性礦業(yè)廢水的影響，具有低營(yíng)養(yǎng)、高鹽、高重金屬的特點(diǎn)，農(nóng)作物的產(chǎn)量較低，某些作物甚至無法生長(zhǎng)。

1.2 樣品采集與分析方法

1.2.1 水樣的采集 在供試農(nóng)田內(nèi)設(shè)置4個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)在0～20、20～40、40～60、60～80、80～100、100～150 cm各安裝1根采水管( 圖1)。采水管的設(shè)計(jì)為雙層PVC管結(jié)構(gòu)，內(nèi)管外徑3 cm、長(zhǎng)度40 cm，管壁布設(shè)均勻小孔，內(nèi)管外包裹400目的尼龍網(wǎng)，防止泥沙進(jìn)入；外管外徑5 cm、長(zhǎng)度44 cm，上半段設(shè)有進(jìn)水孔，外管兩端用硅膠塞密封，并設(shè)置一根軟管用于取水。為減少安裝過程對(duì)土壤的擾動(dòng)，鉆孔后將采水管直接插入到預(yù)定深度，鉆孔所用鉆頭的外徑與采水管的外徑一致。2016年8月完成采水管野外安裝工作，采水管在土壤剖面中穩(wěn)定1個(gè)月后，10月份采集土壤孔隙水樣。

利用真空泵將孔隙水快速抽入到含2 cm厚石蠟層的滅菌樣品瓶中。所采集的水樣一部分用于測(cè)定孔隙水中的還原性物質(zhì)(S2-)，另一部分水樣過0.22 μm濾膜后用于測(cè)定水樣的其他理化性質(zhì)，濾膜上的殘留物用于提取水中的微生物DNA及功能基因分析。

圖1 土壤孔隙水采集管示意圖Fig.1 Illustration of design used to monitor pore water

功能基因Target gene引物Primers引物序列 (5’-3’)Prime sequence (5’-3’)amoA-AOAamoA-1F/amoA-2RGGGGTTTCTACTGGTGGTCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTCamoA-AOBArch-amoAF/Arch-amoARSTAATGGTCTGGCTTAGACGGCGGCCATCCATCTGTATGTnirKCd3aF/R3cdGTSAACGTSAAGGAACSGGGASTTCGGRTGSGTCTTGAnirSnirK876/nirK1040ATCATGGTSCTGCCGCGGCCTCGATCAGRTTGTGGTTnosZnosZ2F/nosZ2RCGCRACGGCAASAAGGTSMSSGTCAKRTGCAKSGCRTGGCAGAAdsrBDSRp2060F/DSR4RCAACATCGTYCAYACCCAGGGGTGTAGCAGTTACCGCA

微生物總DNA采用CTAB法提取[12]。熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)測(cè)定孔隙水中各功能基因的豐度[2,17]。qPCR反應(yīng)在ABI step-one system擴(kuò)增儀上根據(jù)KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix試劑的說明書進(jìn)行，產(chǎn)物的特異性用溶解曲線以及凝膠電泳確定，不同功能基因的qPCR引物及引物序列見表1[18-23]。qPCR的擴(kuò)增效率為80 %～90 %，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2> 0.99。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

Excel 2007用于計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，并繪制表格；SPSS 19.0用于差異顯著性檢驗(yàn)( Duncan法) 和相關(guān)性分析( Pearson法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤剖面孔隙水理化性質(zhì)

2.1.1 土壤剖面孔隙水的pH和電導(dǎo)率 從表2可以看出，土壤剖面孔隙水pH的變化范圍為7.06～7.33，EC的變化范圍為104～199 μs/cm。隨著剖面深度的增加，孔隙水pH逐漸降低，而EC則呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。pH的最小值及EC的最大值均出現(xiàn)在80～100 cm剖面層，其中，0～20 cm剖面層的pH顯著高于80～100 和100～150 cm(P<0.05)，而0～20 cm剖面層的EC則顯著低于80～100 和100～150 cm(P<0.05)。上述結(jié)果表明，土壤剖面孔隙水的pH和EC隨剖面深度變化較為明顯。

2.2 土壤剖面孔隙水中N、S代謝功能基因的豐度

如表4所示，土壤孔隙水0～20 cm層功能基因amoA-AOA與amoA-AOB的比率約為5，隨著剖面深度的增加，二者的比率也逐漸增加，100～150 cm層時(shí)二者的比率達(dá)到38.92；各層孔隙水中nirS基因豐度均大于nirK；5種參與N轉(zhuǎn)換的功能基因中，nosZ基因豐度最大。參與硫還原功能基因dsrB的豐度整體上高于參與N轉(zhuǎn)換的功能基因，且在60～80 cm層時(shí)豐度達(dá)到最大，為1.96×109copies/mL。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)表明，不同剖面深度6種功能基因豐度均無顯著差異。

表2 孔隙水中C、N含量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

注：同一列中不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

Notes: Different letters within a column indicate the significant differences among treatments at 0.05 level. The same as below.

表3 孔隙水中污染物特征(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

如表5所示，土壤剖面孔隙水中參與氨氧化的功能基因amoA-AOA與amoA-AOB呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，參與反硝化的3個(gè)功能基因nirS、nirK、nosZ呈顯著或極顯著正相關(guān)。來自于氨氧化古菌的amoA-AOA與反硝化功能基因nirS、nirK和nosZ也呈顯著或極顯著正相關(guān)，但源于細(xì)菌的amoA-AOB僅與nirK具有較好的相關(guān)性。

2.3 功能基因豐度與孔隙水理化性質(zhì)的相關(guān)性

如表6所示，不同環(huán)境因子對(duì)N、S轉(zhuǎn)化功能基因豐度的影響，其中，EC、亞硝氮與dsrB基因呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Cu與amoA-AOA、nirS基因呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

3 討 論

3.1 土壤孔隙水中功能基因的關(guān)系

氨氧化過程將氨氧化為亞硝氮，是硝化作用的第一個(gè)反應(yīng)步驟，既是限速步驟，也是氮循環(huán)的中心環(huán)節(jié)[24]。參與氨氧化的功能基因amoA-AOA與amoA-AOB的比率在一定程度上可以反映環(huán)境氧含量、營(yíng)養(yǎng)等條件。Santoro[25]在測(cè)定地下河口沉積物中amoA基因豐度時(shí)發(fā)現(xiàn)，amoA-AOA在低氧環(huán)境中是amoA-AOB的10倍，但在好氧環(huán)境中amoA-AOB卻是amoA-AOA的約30倍。在本研究中，隨著土壤剖面深度的增加，參與氨氧化的功能基因amoA-AOA與amoA-AOB豐度的比率也逐漸增加，0～20 cm層時(shí)amoA-AOA/amoA-AOB比率約為5，而在100～150 cm層時(shí)，amoA-AOA與amoA-AOB的比率增加到約39。這種比率的變化趨勢(shì)可能與功能基因的生理代謝機(jī)制有關(guān)，在系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化方面，amoA-AOA形成了一類完全獨(dú)立于amoA-AOB的進(jìn)化分支，它既可進(jìn)行自養(yǎng)代謝，也可以通過混合營(yíng)養(yǎng)方式生活[26]，因此，在氧氣含量不充足的情況下，amoA-AOA的豐度優(yōu)勢(shì)逐漸明顯。與土壤剖面0～20 cm層相比，位于100～150 cm深度的土壤孔隙水中基本處于厭氧狀態(tài)，這也是導(dǎo)致該層具有較高amoA-AOA豐度的原因。

表4 土壤孔隙水中參與N、S代謝功能基因的豐度(copies/mL，平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

表5 孔隙水中N、S代謝功能基因的相關(guān)性

注：*表示在0.05水平上具有顯著相關(guān)性，**表示在0.01水平上具有顯著相關(guān)性，下同。

Notes: *stand for significance at 0.05 level, and **stand for significance at 0.01 level. The same as below.

表6 孔隙水中N、S代謝功能基因與理化性質(zhì)的相關(guān)性

相關(guān)分析(表5)還表明，孔隙水中參與氨氧化過程和反硝化過程的功能基因之間存在較好的相關(guān)性，可能是由于氨氧化過程增加了氧化態(tài)氮的供應(yīng)，從而促進(jìn)了反硝化過程的進(jìn)行[28]。

有研究表明，硫酸鹽還原過程對(duì)反硝化過程存在雙方面的影響：一方面，硫酸鹽還原過程的中間產(chǎn)物(單質(zhì)硫)，可以作為部分自養(yǎng)反硝化菌的電子供體[29]；另一方面，硫酸鹽還原過程會(huì)對(duì)反硝化過程中氧化亞氮還原為氮?dú)怆A段的酶(nosZ編碼的酶)產(chǎn)生抑制作用，使得反硝化過程無法完全進(jìn)行[30]。本研究中，dsrB基因與參與N轉(zhuǎn)化的功能基因之間并未表現(xiàn)出相關(guān)性(表5)，具體原因有待于進(jìn)一步探討。

3.2 土壤孔隙水理化因子對(duì)功能基因豐度的影響

酸性礦業(yè)廢水進(jìn)入農(nóng)田后不僅可導(dǎo)致土壤中Fe、Mn、Cu及硫酸根含量的增加[31]，而且還會(huì)影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[32]。在本研究中，土壤孔隙水中Cu對(duì)amoA-AOA基因豐度起到了顯著促進(jìn)作用(r= 0.430，P<0.05)。Walker[33]在對(duì)海洋中硝化機(jī)制進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，amoA-AOA基因的能量代謝依賴于含有Cu而非Fe的電子傳遞系統(tǒng)，這可能會(huì)影響氨氧化菌對(duì)重金屬Cu 的敏感性，這也可能就是本研究孔隙水中amoA-AOA基因豐度與重金屬Cu含量呈顯著正相關(guān)性的原因。

在本研究中，孔隙水中dsrB基因豐度與EC呈顯著正相關(guān)(r= 0.412，P<0.05)。硫酸鹽還原菌主要參與硫酸根的還原作用[34]，酸性礦業(yè)廢水中主要的陰離子即為硫酸根離子[35]，而硫酸根又是決定酸性礦業(yè)廢水電導(dǎo)率的關(guān)鍵因素，因此dsrB基因豐度與EC呈顯著正相關(guān)是很容易理解的。

4 結(jié) 論

酸性礦業(yè)廢水污染土壤剖面的孔隙水中參與N、S轉(zhuǎn)化的6種功能基因豐度受剖面深度的影響較小，但amoA-AOA與amoA-AOB豐度的比率則隨著剖面深度的增加而增加；nirK基因?qū)Νh(huán)境因子的響應(yīng)較nirS更為敏感，基因豐度整體上低于nirS基因；5種參與N轉(zhuǎn)化的功能基因(amoA-AOA、amoA-AOB、nirK、nirS和nosZ)之間表現(xiàn)出較好的相關(guān)性；土壤孔隙水的EC、亞硝氮含量影響dsrB基因的豐度，孔隙水中Cu對(duì)amoA-AOA和nirS基因豐度產(chǎn)生顯著影響?？偟膩碚f，酸性礦業(yè)廢水污染農(nóng)田土壤剖面孔隙水中氮轉(zhuǎn)化功能基因之間相互作用，功能基因豐度與剖面深度和孔隙水理化性質(zhì)關(guān)系密切。