堿性土上GF677 與毛桃葉片葉綠素合成及葉綠體結(jié)構(gòu)差異性研究

宋海巖，陳 棟，李 靖，鐘小江，楊文淵，祝 進(jìn)，江國良*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所·農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，四川 成都 610066;2.宜賓縣農(nóng)業(yè)局果樹站，四川 宜賓 644600; 3.四川省園藝推廣總站，四川 成都 610016)

【研究意義】四川盆地是我國桃主要栽培地區(qū)之一。近年來，受早春干旱、夏季暴雨以及長期的土壤養(yǎng)分消耗因素影響，龍泉山脈和川中丘陵產(chǎn)區(qū)桃樹黃化現(xiàn)象有愈演愈烈趨勢，部分桃園黃化植株比例高達(dá)90 %，對桃產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大，已成為當(dāng)?shù)靥耶a(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要限制因子之一[1-2]。GF677 (P.amygdalus×P.persica)桃砧木由法國INRA(Institut Nationaldela Recherche Agronomique)于20世紀(jì)60年代雜交選育而成，根系發(fā)達(dá)，長勢健壯，樹冠高大與桃/油桃品種間嫁接親和力強(qiáng)，并具有抗鈣質(zhì)堿性土缺鐵性黃化、耐重茬、耐旱等優(yōu)良特性[3]。目前關(guān)于GF677的研究主要集中于組培快繁技術(shù)上[4-11]，為GF677的大規(guī)模推廣提供了生產(chǎn)條件，但是GF677作為栽培所需的桃砧木品種，其抗鹽堿能力及引入國內(nèi)的適應(yīng)性表現(xiàn)應(yīng)該是我們需要研究的主要內(nèi)容，尤其是在鹽堿地或重茬園區(qū)的研究，這對開展桃砧木抗性育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】郁萬文等人[12-13]對GF677在鹽脅迫和淹水脅迫下的表現(xiàn)研究表明：不同樹種/品種的桃砧耐鹽性排序為蒙古扁桃>山桃>GF677>毛桃>甘肅桃>陜甘山桃>筑波5號>毛櫻桃，同時GF677抗水淹能力也一般。但是GF677在四川盆地石灰性紫色土地區(qū)栽培條件下表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗黃化特性。【本研究切入點】本試驗對GF677在石灰性紫色土上葉片葉綠素合成及葉綠體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以期找出其葉綠素代謝和葉綠體結(jié)構(gòu)差異，為未來抗性桃砧木育種中優(yōu)良親本的篩選和選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗地點

供試材料為抗性桃砧木GF677(扦插苗)，以普通毛桃(實生苗)為對照。

1.2 試驗方法

選取生長勢一致的GF677與毛桃實生苗，單株為1重復(fù)，每個處理設(shè)置5個重復(fù)。自3月10日起每隔1個月左右從每株樹上選取樹冠各方位、無病蟲害新梢中部成熟功能葉10片，拍照后放入液氮帶回實驗室進(jìn)行生理生化指標(biāo)測定及葉綠素合成前體含量測定。

葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量：使用丙酮法，參照李合生等[15]。

葉綠素各合成前體含量測定：5-氨基酮戊酸(ALA)含量、膽色素原PBG含量參照D Mauzerall[16]等人方法；Mg-ProtoⅨ、ProtoⅨ、Pchl使用堿性丙酮提取法，參照劉和平[17]等人方法；UrogenⅢ含量測定參照楊清等人[18]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時期葉片葉綠素各組分含量變化

由圖1可知，堿性土上不同時期GF677葉片和毛桃葉片葉綠素a含量均呈現(xiàn)先下降后上升最后又下降的趨勢，但毛桃在受到堿脅迫后葉綠素a含量下降幅度更大，導(dǎo)致整個生長期毛桃葉片葉綠素a含量始終低于GF677，7月29日至9月29日葉綠素a含量的上升可能與GF677和毛桃對堿性土壤的適應(yīng)所致。在5月5日和5月27日至9月29日之間GF677葉綠素a含量均極顯著(P<1 %)高于毛桃，GF677葉片葉綠素a含量最低值出現(xiàn)在5月27日，最高值出現(xiàn)在7月29日，而毛桃葉片葉綠素a含量最高值出現(xiàn)在5月5日，最低值出現(xiàn)在7月29日。

由圖2可知，堿性土上GF677葉片葉綠素b含量呈現(xiàn)先下降后迅速上升然后又下降最后再略微上升的趨勢，在5月5日和5月27日至9月29日之間葉綠素b含量均極顯著(P<1 %)高于毛桃，葉綠素b含量最低值出現(xiàn)在5月5日，最高值出現(xiàn)在5月27日，而毛桃葉片葉綠素b含量呈現(xiàn)先上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，最高值出現(xiàn)在5月5日，最低值出現(xiàn)在9月29日。GF677葉綠素b含量在5月5日略微下降后能夠迅速恢復(fù)，毛桃在受到堿脅迫后葉片葉綠素b含量下降極為顯著，因此推測毛桃在堿性土上的黃化可能與葉片葉綠素b含量的下降有關(guān)。

圖中**表示該時期同一指標(biāo)在P<1 %水平上差異顯著，*表示該時期同一指標(biāo)在P<5 %水平上差異顯著，下同** in the picture indicators in P<1 % significant level in the same period and * in the picture indicators in P<5 % significant level in the same period，the same as below圖1 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片葉綠素a含量變化Fig.1 Content of chla in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

圖2 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片葉綠素b含量變化Fig.2 Content of chlb in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

由圖3可知，堿性土上GF677葉片類胡蘿卜素(Cx·c)含量呈現(xiàn)先上升后下降然后又上升最終趨于平緩的趨勢，其中在3月10日測定時GF677葉片Cx·c含量顯著(P<5 %)低于毛桃葉片，然而之后GF677葉片Cx·c含量呈現(xiàn)更明顯的增加趨勢，并在5月5日顯著(P<5 %)高于毛桃葉片，隨后GF677葉片Cx·c含量呈現(xiàn)更明顯的下降趨勢，在5月27日和6月29日GF677葉片Cx·c含量極顯著(P<1 %)低于毛桃，最低值出現(xiàn)在3月10日，毛桃葉片類胡蘿卜素含量最低值也出現(xiàn)在3月10日。6月29日后GF677與毛桃葉片類胡蘿卜素的上升可能與葉片的成熟與衰老有關(guān)。

由圖4可知，堿性土上GF677葉片葉綠素總量變化呈現(xiàn)先下降后上升最后又下降的趨勢，其中在3月10日和5月27日至9月29日均極顯著(P<1 %)高于毛桃葉片，葉綠素總量最低值出現(xiàn)在5月5日，最高值出現(xiàn)在7月29日。而毛桃葉片葉綠素總量呈現(xiàn)先略微上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，最高值出現(xiàn)在5月5日，而最低值出現(xiàn)在7月29日。

圖3 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片類胡蘿卜素含量變化Fig.3 Content of carotenoid in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

圖4 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片葉綠素總量變化Fig.4 Content of total chlorophyll in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

由圖5可知，堿性土上GF677葉片葉綠素a/葉綠素b比值變化呈現(xiàn)先上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，在5月5日顯著(P<5 %)低于毛桃，在5月5日至7月29日和9月29日均極顯著(P<1 %)低于毛桃，最低值出現(xiàn)在5月27日，最高值出現(xiàn)在9月2日。而毛桃葉片葉綠素a/葉綠素b比值呈現(xiàn)先下降后上升然后又下降最后再上升的趨勢，最低值出現(xiàn)在5月5日，最高值出現(xiàn)在9月29日，9月29日出現(xiàn)最高值可能與毛桃葉片的衰老及葉綠素b的分解有關(guān)。

2.2 不同時期葉片葉綠素合成前體含量變化

圖6為被子植物體內(nèi)葉綠素合成途徑，在葉綠素合成的15個步驟中，關(guān)鍵步驟包括Glu(Glutamate,谷氨酸)→ALA(Aminolevulinic acid, 氨基酮戊酸)→PBG(Porphobilinogen, 膽色素原)→Uro (Uroorphyrinogen, 尿卟啉)→Proto(Protoporphyrin, 原卟啉)→Mg-Proto (Mg-Protoporphyrin, 鎂原卟啉)→Pchl(Protochlorophyll, 原葉綠素酸)→Chla(Chlorophyll a,葉綠素a)→Chlb (Chlorophyll b, 葉綠素b)，其中任何一步受阻都將影響葉綠素的生物合成[19-24]，選取6種關(guān)鍵物質(zhì)對其含量進(jìn)行動態(tài)測定。

圖5 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片葉綠素a/b比值變化Fig.5 Ratio between chla and chlb in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

箭頭旁阿拉伯?dāng)?shù)字代表調(diào)控該步驟的酶The arrow next to the Arabic numerals indicators regulatory enzyme in the process圖6 被子植物葉綠素合成途徑(參考Beale,2005)Fig.6 The chlorophyll biosynthesis pathway in angiosperms(quoted from Baele 2005)

由圖7可知，堿性土上GF677葉片5-氨基酮戊酸含量(ALA)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，5月5日第一次測定時略微低于毛桃葉片ALA含量，但差異不顯著，之后下降到5月27日顯著(P<5 %)低于毛桃，6月29日至7月29日繼續(xù)下降并極顯著(P<1 %)低于毛桃，最低值出現(xiàn)在7月29日，之后隨著毛桃葉片ALA含量的下降，在9月2日至9月29日GF677葉片ALA含量極顯著(P<1 %)高于毛桃葉片。而毛桃葉片ALA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最高值出現(xiàn)在6月29日，這可能與該時期葉片黃化及ALA代謝受阻有關(guān)。

圖7 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片5-氨基酮戊酸含量變化Fig.7 Content of 5-aminolevulinic acid in leaves of GF677 and wild peach on alkline soil during different periods

圖8 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片膽色素原含量變化Fig.8 Content of PBG in leaves of GF677 and wild peach on alkline soil during different periods

由圖8可知，堿性土上GF677與毛桃葉片膽色素原(PBG)含量均呈現(xiàn)先上升后下降然后又上升的趨勢，最高值都出現(xiàn)在7月29日，但略有不同，在5月27日至6月29日間GF677葉片PBG含量顯著(P<5 %)高于毛桃葉片。

由圖9可知，堿性土上GF677葉片內(nèi)尿卟啉Ⅲ(UrogenⅢ)含量呈緩慢上升趨勢，且一直極顯著(P<1 %)高于毛桃，而毛桃葉片內(nèi)UrogenⅢ含量呈現(xiàn)先上升后略微下降的趨勢，毛桃與GF677葉片內(nèi)各種葉綠素合成前體由尿卟啉Ⅲ開始出現(xiàn)較大差異。

圖9 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片尿卟啉原Ⅲ含量變化Fig.9 Content of UrogenⅢ in leaves of GF677 and wild peach on alkline soil during different periods

圖10 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片原卟啉Ⅸ含量變化Fig.10 Content of ProtoⅨ in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

由圖10可知，堿性土上GF677與毛桃葉片原卟啉Ⅸ含量均呈現(xiàn)先上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，在5月27日至9月29日5個時期均極顯著(P<1 %)高于毛桃，GF677葉片原卟啉Ⅸ含量最低值出現(xiàn)在3月10日，最高值出現(xiàn)在7月29日，而毛桃葉片原卟啉Ⅸ含量最低值出現(xiàn)在7月29日，最高值出現(xiàn)在5月5日。

由圖11可知，堿性土上GF677葉片鎂原卟啉Ⅸ含量呈現(xiàn)先上升后略微下降然后再上升最后又下降的趨勢，在5月27日至9月29日均極顯著(P<1 %)高于毛桃，GF677葉片鎂原卟啉Ⅸ含量最低值出現(xiàn)在3月10日，最高值出現(xiàn)在7月29日，而毛桃葉片鎂原卟啉Ⅸ含量呈現(xiàn)先略微上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，最低值出現(xiàn)在7月29日，最高值出現(xiàn)在5月5日。

由圖12可知，堿性土上GF677葉片原脫植基葉綠素(Pchl)含量呈現(xiàn)先上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，雖然在3月10日第一次測定時GF677葉片Pchl含量顯著低于毛桃，而在5月27日至9月29日均極顯著(P<1 %)高于毛桃，最低值出現(xiàn)在3月10日，最高值出現(xiàn)在7月29日，而毛桃葉片原脫植基葉綠素含量呈現(xiàn)先略微上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，最高值出現(xiàn)在5月5日，最低值出現(xiàn)在7月29日。

圖11 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片鎂原卟啉Ⅸ含量變化Fig.11 Content of Mg-ProtoⅨ in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

圖12 堿性土上GF677和毛桃不同時期葉片原脫植基葉綠素含量變化Fig.12 Content of Pchl in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

2.3 葉片葉綠素各組分及葉綠素前體間相關(guān)性分析

圖13為葉綠素a/b間循環(huán)路徑圖[13]，表1為GF677、毛桃葉片葉綠素各組分及葉綠素前體間相關(guān)性分析。基于圖6高等植物葉綠素合成途徑，推測對于正常植株體內(nèi)這些葉綠素組分(除類胡蘿卜素)與其合成前體的變化應(yīng)該呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，然而根據(jù)對堿性土上GF677和毛桃葉綠素各組分及合成前體之間相關(guān)性分析(表1)發(fā)現(xiàn)，毛桃在這幾個步驟中的PBG→Uro和Uro→Proto出現(xiàn)負(fù)相關(guān)系數(shù)-0.413和-0.148，其余步驟均呈正相關(guān)系數(shù)。而GF677在這幾個步驟中的PBG→Uro過程相關(guān)系數(shù)為-0.908，達(dá)顯著負(fù)相關(guān)(P<5 %)，在Uro→Proto和Chla→Chlb這兩個步驟相關(guān)系數(shù)分別為-0.599和-0.391，其余步驟均呈正相關(guān)系數(shù)。結(jié)合對各葉綠素組分及合成前體含量的分析結(jié)果(圖7～12)，推測毛桃在PBG向Uro合成步驟及Uro向Proto合成步驟轉(zhuǎn)化受阻，而GF677與毛桃葉綠素合成前體含量開始出現(xiàn)較大差異正好從Uro開始，并且毛桃葉片內(nèi)Uro含量始終極顯著低于GF677。而結(jié)合葉綠素a/b間循環(huán)途徑，我們推測GF677葉片內(nèi)葉綠素前體合成受阻時Chla能夠向Chlb轉(zhuǎn)化一部分，從而保證正常生長所需的Chlb含量，而毛桃Chla降低時Chlb隨之而明顯降低，這可能是GF677在Chla→Chlb步驟出現(xiàn)負(fù)相關(guān)性的原因。

3 討 論

植物在受到鹽堿脅迫時葉片葉綠素代謝會受阻，葉綠素合成某些前體(如ALA、PBG等)會積累在植物體內(nèi)[26]。GF677葉片葉綠素a含量、葉綠素b含量以及葉綠素總量在均大于毛桃，尤其是GF677在受到堿脅迫時葉片葉綠素b含量可以看到先下降后又重新增加，而毛桃葉片葉綠素b合成在受阻后在5月27日至7月29日均極顯著(P≤1 %)低于GF677，表明在受到堿脅迫后，GF677葉片葉綠素b合成途徑?jīng)]有受到阻礙，而毛桃葉綠素b含量下降可能是其葉片出現(xiàn)黃化的主要原因。而賈俊麗等人[27]對桑樹斑葉突變體的葉綠素合成特性研究表明突變體葉片黃化部分的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均有不同程度的下降，其中葉綠素a的減少最顯著，可能是導(dǎo)致突變體葉色黃化的直接原因，并未分析葉綠素a、b之間可能存在的聯(lián)系以及葉綠素b與突變體葉色黃化之間的關(guān)系。

Chl.葉綠素; Chlide.脫植基葉綠素;CS.葉綠素合酶; Chlase.葉綠素分解酶; CAO.葉綠素加氧酶; CBR.葉綠素b還原酶; CAR.葉綠素a還原酶Chl.chlorophyll; Chlide.chlorophyllide;CS.chlorophyll synthase; Chlase. chlorophyllase; CAO.chlorophyllide a oxygenase; CBR.chlorophyll(ide) b reductase; CAR.hydroxy-chlorophyll(ide) a reductase圖13 葉綠素循環(huán)(參考W. Rüdiger，2002)Fig.13 The chlorophyll cycle(quoted from W. Rüdiger，2002)

對堿性土上GF677和毛桃葉片葉綠素合成前體進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，毛桃葉片ALA含量在受到堿脅迫后會先上升后下降，在葉片內(nèi)出現(xiàn)積累，UrogenⅢ含量一直極顯著低于GF677，表明其ALA向PBG轉(zhuǎn)化步驟及PBG向Uro轉(zhuǎn)化步驟在受到堿脅迫時受阻。王穎等人[28]和孫錦等人[29]對菠菜在鹽脅迫下的葉綠素合成前體研究也表明PBG向Uro轉(zhuǎn)化步驟在受到鹽脅迫時受阻。張麗等人[30]對鹽堿脅迫下番茄幼苗葉綠素合成前體的影響也表明PBG向Uro轉(zhuǎn)化步驟受阻，噴施Spd后可緩解部分步驟。而GF677葉片內(nèi)ProtoⅨ、Mg-ProtoⅨ以及原脫植基葉綠素含量在受到堿脅迫后短時間下降之后又重新升高，表明GF677在堿性土上具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，在受到堿脅迫后能在較短時間內(nèi)調(diào)整葉綠素前體的合成。

結(jié)合對各葉綠素組分及合成前體含量的分析結(jié)果，認(rèn)為毛桃在PBG向Uro合成步驟及Uro向Proto合成步驟轉(zhuǎn)化受阻，而GF677與毛桃葉綠素合成前體含量開始出現(xiàn)較大差異正好從Uro開始，毛桃葉片內(nèi)Uro含量始終極顯著低于GF677，表明PBG向Uro步驟及Uro向Proto步驟對桃砧木抗黃化能力的差異分化具有重要意義。調(diào)控這幾個步驟的關(guān)鍵酶[31]是：羥甲基后膽色素原合酶(hydroxymethylbilane synthase)[膽色素原合酶脫氨酶(Porphobilinogen deaminase)]、尿卟琳原Ⅲ合酶(uroporphyrinogenⅢ synthase)[尿卟琳原Ⅲ共合酶(uroporphyrinogenⅢ co-synthase)]、尿卟琳原脫羧酶(uroporphyrinogen decarboxylase)、糞卟琳原氧化脫羧酶(coproporphyrinogen oxidative decarboxylase)、原卟琳原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase)，對這些酶以及調(diào)控這些酶相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行探究，將會為我們進(jìn)一步了解GF677抗黃化機(jī)制提供依據(jù)。

表1 GF677、毛桃葉片葉綠素各組分及葉綠素前體間相關(guān)性分析

注：以對角線為界，右上方為GF677，左下方為毛桃，*表示相關(guān)性達(dá)0.05顯著性水平，**表示相關(guān)性達(dá)0.01顯著性水平，下同。

Notes: The upper right is on behalf of GF677 and the bottom left is on behalf of wild peach,divided by a diagonal line.* indicators inP≤5 % significant level,**indicators inP≤1 % significant level,the same as below.

Chla和Chlb之間的相互轉(zhuǎn)化稱為“葉綠素循環(huán)”，在不同生理條件下調(diào)控它們之間的比值具有重要的意義[32]。Klein等人[33]認(rèn)為質(zhì)體核糖體反應(yīng)中心新生肽(RCs)對葉綠素a有更高的親合性，葉綠素b是由葉綠素a氧化而來,所以當(dāng)RCs不再整合葉綠素a時,富余的葉綠素a才有部分氧化成葉綠素b。部分葉綠素a合成的減少，將會擴(kuò)大對葉綠素b合成的抑制[34]，導(dǎo)致葉綠素a/b比值升高，這與本試驗中觀察到的毛桃葉片內(nèi)葉綠素a、葉綠素b合成同時受到抑制相一致。葉綠素b減少也會導(dǎo)致光合單元減少和葉綠體類囊體膜的發(fā)育不良。GF677葉片內(nèi)葉綠素前體合成受阻時葉綠素a含量短暫降低時葉綠素b含量反而會上升，據(jù)此推測GF677葉片內(nèi)葉綠素前體合成受阻時Chla能夠向Chlb轉(zhuǎn)化一部分，從而保證正常生長所需的Chlb含量，這可能是GF677在Chla→Chlb步驟出現(xiàn)負(fù)相關(guān)性的原因。而毛桃Chla降低時Chlb隨之而明顯降低。結(jié)合圖13，今后對調(diào)控Chla→Chlb轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物(7-羥甲基葉綠素酸脂a、葉綠素酸脂a、葉綠素酸脂b等)及相關(guān)酶(CAO，CS，Chlase等)活性的分析將有助于進(jìn)一步探究毛桃調(diào)控毛桃葉片Chla→Chlb受阻的原因。

4 結(jié) 論

本研究以抗性桃砧木資源GF677和普通毛桃為試驗材料，比較其在堿性土上葉綠素合成途徑各個步驟的前體及組分含量差異，并分析其組分間相關(guān)系數(shù)。最終發(fā)現(xiàn)：①在5-10月份多數(shù)測定時期，堿性土上GF677葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量及UrogenⅢ、ProtoⅨ、Mg-ProtoⅨ和原脫植基葉綠素含量均高于毛桃；GF677葉片內(nèi)葉綠素b、ProtoⅨ、Mg-ProtoⅨ以及原脫植基葉綠素含量在受到堿脅迫后能在短時間內(nèi)恢復(fù)甚至超越前期值，而毛桃葉片葉綠素a、b合成受阻后急劇下降，結(jié)合對各葉綠素組分及合成前體含量的分析結(jié)果，因此毛桃葉綠素b含量下降可能是其葉片黃化的主要原因。②植物葉綠素合成PBG→Uro、Uro→Proto兩個步驟，及葉綠素循環(huán)中葉綠素a→葉綠素b轉(zhuǎn)化是否受阻是桃砧木抗黃化能力的重要判斷指標(biāo)。本試驗為今后桃砧木育種工作中的篩選高鐵吸收效率親本提供了基礎(chǔ)性工作。