葉春秀,趙增強,張國麗,于 航,莊振剛,謝宗銘*
(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)所/作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團重點實驗室,新疆 石河子 832000;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),新疆 烏魯木齊 830000)
【研究意義】蛋白質(zhì)的可逆磷酸化是生物體中普遍存在的一種調(diào)節(jié)機制,它幾乎涉及所有的生理和病理過程。如光合作用、基因表達、細胞的生長發(fā)育、糖代謝、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、甚至癌變等等。據(jù)估計,真核生物1 %~3 %的基因編碼蛋白激酶,而植物中可能有2 %~3 %的基因編碼蛋白激酶,這些蛋白激酶參與了環(huán)境刺激和植物激素等多種信號在細胞內(nèi)的傳遞[1-3]。雖然植物蛋白激酶的研究發(fā)展迅,但仍然遠遠落后于動物和人類,許多蛋白激酶的生物學(xué)功能還不清楚,但也有所進展,近來在植物中也發(fā)現(xiàn)了分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-actived Protein Kinase, MAPK)的相似蛋白,MAPK(ERKs)是一族胞漿內(nèi)廣泛分布的含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白質(zhì)激酶[4-9]。MAPK 受雙重磷酸化,是真核蛋白激酶的一種特殊分類,能在絲氨酸、蘇氨酶、酪氨酸殘基上磷酸化。在MAPKs 的活化環(huán)中激活的磷酸化發(fā)生在保守的Thy-X-Tyr 基元中。MAPK 通過使轉(zhuǎn)錄因子磷酸化而改變基因的表達水平。MAPK 是真核信號傳遞中的關(guān)鍵因素,MAPKs 可能參與各種發(fā)育或脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)。有研究表明:一些植物生長因子如植物生長素、乙烯可以活化MAPK等。另外,研究表明小麥上TaLRK蛋白激酶家族基因能夠參與小麥抗白粉病反應(yīng)[3]?!厩叭搜芯窟M展】甜瓜作為新疆的特色水果之一,其蛋白激酶的研究將為甜瓜的基礎(chǔ)代謝、抗逆和抗病蟲害的機理研究奠定基礎(chǔ),并且目前甜瓜蛋白激酶的研究還屬于零星研究,遠未能構(gòu)成完整的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)[10]?!颈狙芯壳腥朦c】本項目組根據(jù)NCBI上已報道的其它物種的蛋白激酶類基因,比對相對保守的序列,設(shè)計相關(guān)的引物,采用RT-PCR方法獲得了CmPKC的部分序列,根據(jù)部分序列的測序結(jié)果設(shè)計引物,分別采用3’ RACE和5’ RACE技術(shù)獲得了該基因的全長序列?!緮M解決的關(guān)鍵問題】該基因的克隆與表達分析將為進一步研究蛋白激酶類基因在抗病性調(diào)控過程中所起的作用及下一步構(gòu)建植物表達載體及基因沉默奠定研究基礎(chǔ)。
抗白粉病與不抗白粉病的甜瓜材料由新疆兵團第六師科學(xué)研究所提供,種植于新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所實驗室。
RNA Trizol提取試劑盒、TaqDNA 聚合酶、DNA 回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記、T4DNA連接酶購自天根公司;3’及5’-RACE試劑盒、克隆載體 pMD 19-T Vector購自 TaKaRa 公司;熒光定量試劑盒購自全士金公司;Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司。
1.2.1 總RNA的提取 總RNA的提取采用天根Trizol試劑盒,根據(jù)操作說明完成。材料為2對真葉期的白粉病抗病與不抗病的甜瓜幼苗及接菌0,1,5,9,24 h不同抗性的材料,液氮速凍,-80 ℃保存用于RNA的提取。
1.2.2 cDNA的合成及基因部分序列的克隆 參照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 合成cDNA第一鏈,根據(jù)相對保守序列設(shè)計引物,進行部分序列的擴增。
1.2.3 3’ RACE和5’ RACE 參照TARAKA試劑盒說明書,以Total RNA為模板,使用3′ RACE adaptor引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成lstStrand cDNA,使用上游外側(cè)特異性引物(GSP1,表3)和3′ RACE Outer Primer進行1stPCR反應(yīng),再使用上游內(nèi)側(cè)特異性引物(GSP2)和3′ RACE Inner Primer進行2ndPCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物連接PMD9-T進行TA克隆.挑選陽性克隆,送給公司測序。
5’RACE。使用Alkaline Phosphatas去掉Total RNA 中裸露的5’磷酸基團. 用Tobacco Acid Pyrophosphatase去掉mRNA 的5’帽子結(jié)構(gòu),保留一個磷酸基團。使用T4RNALigase將5’RACE Adaptor連接到去帽后的mRNA 上,然后以此mRNA 為模板,使用Reverse Transcrip-tase M-MLV (RNase H.),Random 9 mers進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。使用下游外側(cè)特異性引物GSP3和5’ RACE Outer Primer進行Outer PCR反應(yīng),再使用下游內(nèi)側(cè)特異性引物GSP4和5′RACE Inner Primer進行Inner PCR反應(yīng) PCR產(chǎn)物連接PMD19-T,TA克隆,挑選陽性克隆,送公司測序。
1.2.4 熒光定量及半定量檢測 利用實時熒光定量 PCR 的方法檢測CmPKC基因在不同抗性甜瓜材料及不同接種時間點的相對表達量。上游引物序列為:5’-CTTGCCTTCTTTGCTTGG-3’;下游引物序列為:5’-TCTTCTTGGCGGAGTGGT-3’。用PR0961402 36實時熒光PCR 檢測系統(tǒng)進行檢測,反應(yīng)體系如下:10 μl 2× SYBR?Premix ExTaqTM,正反向引物均為 0.4 μl,cDNA 模板 2 μl;加 ddH2O至 20 μl。反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,35 個循環(huán),實時 PCR反應(yīng)以甜瓜18S rDNA為內(nèi)參,每個反應(yīng)重復(fù) 3 次。
1.2.5 煙草轉(zhuǎn)化及驗證 采用常規(guī)的葉盤法及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法進行煙草的轉(zhuǎn)化,獲得轉(zhuǎn)化煙草植株后進行陽性檢測,檢測引物采用部分基因序列引物和載體NPTII引物進行,將同時擴增出條帶的植株定位陽性植株,進行移栽,收獲種子保存,用于后期實驗。
本實驗根據(jù)甜瓜葉片特性采用天根Trizol試劑盒進行RNA的提取,參照說明書進行相應(yīng)的操作,采用1 %的瓊脂糖凝膠進行RNA質(zhì)量與濃度的檢測,檢測結(jié)果表明提取的RNA濃度與質(zhì)量較好,能夠滿足后期的實驗需要(圖1)。
圖1 RNA提取質(zhì)量檢測Fig.1 Quality of RNA of Cucumis melon L.
以不同抗性甜瓜材料的cDNA為模板,以中間部分序列引物進行擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測發(fā)現(xiàn)在約2600 bp處有一條亮帶(圖2)。將此片段進行回收純化,連接PMD19-T Vector 連接,轉(zhuǎn)化檢測后進行測序,測序結(jié)果顯示該片段的大小為2500 bp,與其他植物的類似蛋白激酶類基因同源性較高。
通過3’RACE和5’RA CE分別獲得了約500bp的3’端片段和400 bp的5’端片段(圖3)。測序結(jié)果表明,其序列前后分別能與CmPKC基因中間序列前后吻合,說明獲得了甜瓜CmPKC基因的3’端和5’端,然后將中間片段,3’端和5’端片段拼接,設(shè)計全長引物進行擴增,最終獲得的CmPKC基因長約為2914 bp,開放閱讀框為2493 bp,編碼831個氨基酸(圖3)。
圖2 CmPXC基因中間部分序列擴增圖譜Fig.2 PCR amplification of CmPKC of Cucumis melon L.
如圖4所示,利用NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫對CmPKC的同源基因氨基酸序列進行比對和搜索,結(jié)果顯示,CmPKC與已報道的香瓜蛋白激酶不同剪接體,黃瓜、楊樹、歐洲油菜、羽衣甘藍、蕪菁等植物的蛋白激酶類似基因氨基酸具有較高的同源性,其中與甜瓜G-type lectin S-receptor-like serine/threonine-protein kinase 剪接體2同源性最高,達到88 %。
A.3′-RACE;B.3′-RACE;C.Full length圖3 甜瓜CmPKC基因3’ RACE,5’ RACE和全長序列擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of 3’, 5’end and full length of CmPKC gene
The amino acid sequences used to build up the phylogenic tree were: Cucumis melo transcript variant X2(XM008463932.2); Cucumis melo transcript variant X1(XM017047356.1); Cucumis melo transcript variant X3(XM017047360.1); Cucumis melo transcript variant X4(XM017047361.1); Cucumis sativus mRNA (XM011661496.1); Cucumis melo mRNA (XM008462843.2); Populus euphratica(XM011014277.1); Brassica napus RKS1(XM013839662.1); Brassica napus SD2-5(XM013864066.1); Brassica pleracea SD2-5(XM013738810.1); Brassica rapa SD2-5(XR629743.1)圖4 CmPXC與同源基因編碼蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenic tree of CmPKC and protein coded by by its homologous genes
A:抗性材料接菌后相對表達量;B:感病材料接菌后相對表達量A:Resistance material;B: Susceptibility material圖5 CmPKC基因在甜瓜白粉病抗性及感病材料上接菌后的相對表達量Fig.5 Expression quality of CmPKC in different material of Cucumis melon L.
利用甜瓜的18S作為內(nèi)參,對CmPKC基因在不同抗性材料上進行熒光定量PCR分析,結(jié)果表明在抗性材料上,接菌9 h后該基因的表達量最高(圖5A),而在感病材料上接菌5 h后該基因的表達量最高(圖5B),與現(xiàn)有報道的一個與甜瓜感病相關(guān)MLO家族基因表達量變化規(guī)律一致,但表達量遠遠不及該家族基因,說明所獲得的基因可能與甜瓜白粉病的感病相關(guān),且屬于早期應(yīng)答基因類型;通過對不同接菌時間的抗病與感病材料CmPKC基因轉(zhuǎn)錄水平定量分析顯示該基因在甜瓜白粉病上的抗性機制類似于MLO基因在植物上對白粉病的抗性機制,在抗性材料上在接菌24 h前出現(xiàn)的表達高峰可能與乳突反應(yīng)的發(fā)生有一定的聯(lián)系,當(dāng)完成乳突反應(yīng)后,病原菌即被阻隔在細胞之外直至失去侵染活性,隨即表達量下降。而感病品種的表達量在24 h 后開始上升,且高峰出現(xiàn)在72 h。由于24 h 內(nèi)是白粉菌完成侵入的關(guān)鍵時期,在抗病品種24 h前出現(xiàn)了表達高峰,推測抗病材料中CmPKC基因可能直接參與了抗病反應(yīng)。而感病品種由于峰值反應(yīng)的延遲,錯過了抵抗病原菌侵入的最佳時機,導(dǎo)致了植物感病(圖6)。
提取轉(zhuǎn)化煙草及野生煙草植株的基因組DNA,采用基因部分序列引物及NPTII基因引物分別進行PCR檢測,最終選擇能夠同時擴增出目的基因和NPTII基因的植株定位陽性植株(圖7),經(jīng)過后期觀察,該基因在起抗逆作用同時還具有促進煙草開花的功能,其較野生植株開花期提前很多(圖8)且抗逆性有所增加,其在抗病過程中所起的作用有待深入分析和研究。
圖7 轉(zhuǎn)基因煙草植株目的基因及NPTII鑒定Fig.7 PCR amplification of CmPXC and NPTII
圖8 轉(zhuǎn)基因煙草提前開花植株與對照植株Fig.8 Comparation of standard and early flowering plants
在植物體內(nèi),存在著大量參與植物組織形成和器官發(fā)育的激酶。 擬南芥中的ERECTA基因編碼含LRR 的激酶,其與器官的形成及營養(yǎng)生長有關(guān)[10];HAESA也是一種含LRR 的激酶,參與了花組織器官的脫落[11];CLAVATA與根和花的分生組織中細胞的增殖和組織形成有密切的關(guān)系[12];另外,WAK(wall2associated receptor2like kinase) 通過細胞的伸長生長,調(diào)控側(cè)根的生長發(fā)育[13];AtSERK1編碼一種參與體細胞胚胎發(fā)生的類受體蛋白激酶;SCM和根的表皮細胞發(fā)育有關(guān)[14-15]。矮牽牛中的PRK1在花粉粒中特異表達,在小孢子減數(shù)分裂后的花粉發(fā)育和授粉中起信號傳遞作用,保證花粉粒正常發(fā)育和萌發(fā)[16];玉米的Crinkly4 基因編碼的激酶參與調(diào)控葉表皮細胞和胚乳中糊粉細胞的分化[17]。
另外,已鑒定的抗病基因中有多個類受體激酶,對該類抗病基因的克隆及其序列分析和功能的研究,促進了人們對激酶在植物抗病中作用的認識。水稻抗白葉枯病基因Xa21 和Xa26都編碼一個具有胞外LRR 區(qū)的絲/蘇氨酸激酶,LRR 區(qū)參與蛋白質(zhì)相互作用[18-19]。水稻抗稻瘟病基因Pi2d2編碼的蛋白質(zhì)胞外是B 凝集素(B2lectin) 結(jié)構(gòu),胞內(nèi)是絲/蘇氨酸激酶區(qū)[20]。Martin 等從番茄中克隆的抗丁香假單孢桿菌(Pseudomonassyingaepv.tomato) 的基因Pto,編碼一個細胞內(nèi)的蛋白激酶[21]。 擬南芥的FLS2 基因,編碼含LRR 結(jié)構(gòu)域的類受體激酶,在植物抗病和病原菌識別中起重要作用。大麥的Rpg1基因編碼的激酶抗銹病[22]。小麥抗葉銹病基因Lrk10 編碼胞外含有S結(jié)構(gòu)域的受體蛋白激酶[23-24]。
本文通過同源基因克隆,步移和RACE法成功克隆出CmPKC基因全長,其開放閱讀框為2493 bp,編碼831個氨基酸,與已報道的甜瓜蛋白激酶不同剪接體,黃瓜、楊樹、歐洲油菜、羽衣甘藍、蕪菁等植物[8]的蛋白激酶類似基因氨基酸具有較高的同源性,其中與甜瓜G-type lectin S-receptor-like serine/threonine-protein kinase 剪接體2同源性最高,達到93 %。對不同抗性的甜瓜材料進行白粉菌接種后,半定量和熒光定量分析結(jié)果顯示該基因與目前報道的甜瓜MLO基因家族表達量在不同抗性材料上的變化趨勢一致,推測該基因在甜瓜白粉病上的抗性機制可能類似于MLO基因在植物上對白粉病的抗性機制,且屬于早期應(yīng)答基因,即在抗性材料上在接菌24 h前出現(xiàn)的表達高峰可能與峰值反應(yīng)的發(fā)生有一定的聯(lián)系,當(dāng)完成峰值反應(yīng)后,在表面產(chǎn)生凸起,病原菌即被阻隔在細胞之外直至失去侵染活性,隨即表達量下降。而感病品種的表達量在24 h 后開始上升,且峰值出現(xiàn)在72 h。由于植物24 h內(nèi)是白粉菌完成侵入的關(guān)鍵時期,在抗病品種24 h前就出現(xiàn)了表達高峰,推測抗病材料中的CmPKC基因可能直接參與了抗病反應(yīng),而感病品種由于峰值反應(yīng)的延遲,錯過了抵抗病原菌侵入的最佳時機,導(dǎo)致了甜瓜感病,具體調(diào)控途徑有待于進一步分析。轉(zhuǎn)基因煙草鑒定顯示該基因可能還參與植株的生長發(fā)育過程,還需后期經(jīng)過進一步的鑒定確定其具體參與的調(diào)控路徑。