18F標(biāo)記的正電子藥物中氨基聚醚（2.2.2）測(cè)定方法研究

姚 靜，賈娟娟，弓全勝，許曉平，袁慧瑜，施亞琴

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 200032

18F標(biāo)記的正電子藥物如18F-FDG是目前臨床應(yīng)用最廣泛的正電子類放射性藥物。氨基聚醚（Kryptofix 2.2.2）是制備18F-FDG及多種18F標(biāo)記正電子藥物中最常用的相轉(zhuǎn)移催化劑（圖1），其作用為使18F進(jìn)入乙腈介質(zhì)并與前體化合物發(fā)生親核取代反應(yīng)。氨基聚醚（2.2.2）具有一定的毒性，其大鼠半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）為（35±2）mg/kg（靜脈注射）［1］，因此有必要對(duì)18F標(biāo)記正電子藥物中殘留的氨基聚醚（2.2.2）含量進(jìn)行控制。

文獻(xiàn)報(bào)道的氨基聚醚（2.2.2）檢測(cè)方法主要有5種。① 紫外分光光度法：氨基聚醚在pH=6.4的檸檬酸-氫氧化鈉緩沖液介質(zhì)中與Pb（Ⅱ）形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，在253 nm處有最大吸收，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定18F-FDG中的氨基聚醚（2.2.2）［2］。② 氣相色譜法：采用氮磷檢測(cè)器，氨基聚醚（2.2.2）在OV-101毛細(xì)管柱中的保留時(shí)間為2.4 min，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定18F-FDG中的氨基聚醚（2.2.2）［3］。③ 高效液相色譜法：采用反相色譜柱，以乙腈-50 mmol/L乙酸銨溶液（1∶1）為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，氨基聚醚（2.2.2）的保留時(shí)間為3.2 min。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定18F-FDG中的氨基聚醚（2.2.2）［4］。④ 液質(zhì)聯(lián)用法：采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）方式測(cè)定［M+H］+，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定18F藥物中的氨基聚醚（2.2.2）［5］。⑤ 薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）碘顯色法：采用硅膠板，以甲醇-氨水（90∶10）為展開(kāi)劑，點(diǎn)樣量為50或100 μL，晾干后在碘蒸氣中顯色［6］。由于18F正電子藥物的有效期一般只有6 h，前4種方法均需要使用分析儀器，操作較為繁瑣，不利于生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；第5種方法較為便捷，但是18F標(biāo)記的放射性藥物注射液多為水溶液，點(diǎn)樣體積過(guò)大時(shí)耗時(shí)較長(zhǎng)，亦不利于生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

圖1 氨基聚醚（2.2.2）的結(jié)構(gòu)示意圖

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局標(biāo)準(zhǔn)18F-FDG注射液YBH05262005和YBH02872010均采用紫外分光光度法在253 nm處測(cè)定18F-FDG注射液中氨基聚醚（2.2.2）的含量，限度為25 μg/mL?！睹绹?guó)藥典》［7］采用TLC碘顯色法測(cè)定，限度為50 μg/mL。《歐洲藥典》［8］采用斑點(diǎn)顯色反應(yīng)法測(cè)定，限度為2.2 mg/V（V為以mL計(jì)的最大推薦劑量）。在國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高的研究中，筆者對(duì)18F-FDG注射液中的氨基聚醚（2.2.2）檢測(cè)方法進(jìn)行深入探討，系統(tǒng)比較以上3種方法檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：① 紫外分光光度法中空白溶液的背底較高，工作曲線上各濃度點(diǎn)的吸光度均低于0.2，不在《中國(guó)藥典》推薦的0.3～0.7之間，容易引入測(cè)量誤差；且紫外光譜法專屬性較差，可能會(huì)存在干擾物質(zhì)，如個(gè)別工藝中使用的檸檬酸鈉緩沖液會(huì)產(chǎn)生干擾。② 《美國(guó)藥典》方法需要用特定的硅膠G板（Alltech catalog No.805021），不同品牌的薄層板對(duì)顯色影響較大，有的無(wú)法顯色；加大點(diǎn)樣量后，由于供試品溶液為水溶液，點(diǎn)樣時(shí)間較長(zhǎng)，展開(kāi)后斑點(diǎn)顯色效果不好。③ 《歐洲藥典》采用斑點(diǎn)顯色反應(yīng)法進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度好，操作快捷。因此，筆者在《歐洲藥典》方法的基礎(chǔ)上開(kāi)展研究和改進(jìn)，并在18F-FDG注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中運(yùn)用，納入了2015年版《中國(guó)藥典》。本研究詳細(xì)介紹方法建立過(guò)程，并將該方法推廣至其他18F標(biāo)記的正電子藥物中氨基聚醚（2.2.2）的檢測(cè)，結(jié)果顯示，該方法可以快速、有效地檢出氨基聚醚（2.2.2），具有一定的普適性。

1 材料和方法

1.1 試劑及材料

氯鉑酸和碘化鉀購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為分析純；氨基聚醚（2.2.2）購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；乙醇購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司，為藥用乙醇，純水為Millipore純水機(jī)所制。

硅膠板1：TLC Silica Gel 60F 254［德國(guó)默克公司（玻璃硅膠板）］；硅膠板2：G板［青島譜科分離材料有限公司（玻璃硅膠板）］；硅膠板3：G板［青島海洋化工廠分廠（玻璃硅膠板）］；硅膠板4：DC-Fertigfolien Polygram SIL G/UV254［Macherey-Nagel GmbH & Co. KG，Germany（塑料硅膠板）］。微量進(jìn)樣器為10 μL規(guī)格，移液器為0.5～10.0 μL規(guī)格。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備

① 氯鉑酸溶液：稱取氯鉑酸1.0 g，加入純水10 mL溶解，濃度為100 g/L。② 碘化鉀溶液：稱取碘化鉀6.0 g，加入純水100 mL溶解，濃度為60 g/ L。③ 氨基聚醚（2.2.2）對(duì)照溶液：取氨基聚醚（2.2.2）25 mg，精密稱定，加入純水溶解并稀釋至250 mL，濃度為100 μg/mL。④ 限度對(duì)照溶液：精密量取氨基聚醚（2.2.2）對(duì)照溶液與等體積的純水混合，濃度為50 μg/mL。⑤ 系統(tǒng)適用性溶液：精密量取氨基聚醚（2.2.2）對(duì)照溶液與等體積的供試品溶液混合，濃度為50 μg/mL。

1.2.2 薄層板的預(yù)處理

取氯鉑酸溶液3 mL，加入純水97 mL、碘化鉀溶液100 mL，混勻，備用。將不同品牌的硅膠G薄層板分別浸泡在上述溶液中5～10 s，室溫下避光干燥12 h。

1.2.3 點(diǎn)樣

用移液器吸取供試品溶液、供試品的基質(zhì)溶液、限度對(duì)照溶液及系統(tǒng)適用性溶液適量，分別點(diǎn)于經(jīng)過(guò)預(yù)處理的同一硅膠G薄層板上，1 min后檢視。

1.2.4 檢視

系統(tǒng)適用性溶液應(yīng)與限度對(duì)照溶液類似，與基質(zhì)溶液比較，斑點(diǎn)中心顯深藍(lán)色圓或圓環(huán)；供試品溶液的斑點(diǎn)中心如顯深藍(lán)色應(yīng)淺于限度對(duì)照溶液中心的深藍(lán)色（50 μg/mL）。

1.2.5 供試品溶液

18F-FDG為各醫(yī)療機(jī)構(gòu)提供，基質(zhì)溶液為0.9%NaCl溶液或注射用水；18F-FES和18F-FLT由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供，基質(zhì)溶液為10%乙醇溶液。

2 結(jié) 果

2.1 點(diǎn)樣方式的選擇

分別采用毛細(xì)管、微量進(jìn)樣器和移液器3種方式點(diǎn)樣，均可以產(chǎn)生深藍(lán)色圓點(diǎn)或圓環(huán)（圖2）。前2種方式點(diǎn)樣時(shí)，氨基聚醚（2.2.2）聚集在點(diǎn)樣處形成1個(gè)小圓點(diǎn)，但不同人操作時(shí)形狀會(huì)有所差異，不易對(duì)結(jié)果進(jìn)行描述；且微量進(jìn)樣器點(diǎn)同樣體積的樣品所需時(shí)間較長(zhǎng)，不利于放射性藥物的操作。采用移液器點(diǎn)樣，只要將液體全部擠出，在吸頭尖部形成液滴，輕觸硅膠板，即可形成圓環(huán)或者圓；整個(gè)操作過(guò)程僅需要幾秒鐘，且不同的人操作重現(xiàn)性好。

圖2 點(diǎn)樣方式對(duì)氨基聚醚顯色反應(yīng)的影響

2.2 干擾實(shí)驗(yàn)

在研究中發(fā)現(xiàn)，紫外分光光度法測(cè)定時(shí)，工藝處方中的檸檬酸鈉緩沖液對(duì)測(cè)定有干擾，紫外光譜顯示在253 nm處有吸收，從而干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此考察了檸檬酸鈉緩沖液對(duì)薄層板上顯色反應(yīng)的干擾。將檸檬酸鈉緩沖液點(diǎn)樣，不顯色；將18F-FDG供試品與檸檬酸鈉緩沖液混合后點(diǎn)樣，也不顯色；將18F-FDG供試品、氨基聚醚（2.2.2）對(duì)照溶液與檸檬酸鈉緩沖液混合后點(diǎn)樣，顯深藍(lán)色圓環(huán)。結(jié)果表明，檸檬酸鈉緩沖液不干擾測(cè)定。

2.3 檢出限

量取氨基聚醚（2.2.2）對(duì)照溶液，用純水逐級(jí)稀釋，形成濃度為100、50、25、12.5和6.25 μg/mL的系列溶液。每個(gè)濃度由低到高、從左往右依次點(diǎn)樣，以純水為空白對(duì)照。稀釋至12.5 μg/mL時(shí)仍可形成深藍(lán)色的圓或圓環(huán) ，至6.25 μg/mL時(shí)，藍(lán)色在硅膠板1上可見(jiàn)，在硅膠板2上幾乎不可見(jiàn)?？紤]到硅膠板對(duì)檢出限的影響，將12.5 μg/mL作為本方法的檢出限（圖3）。

圖3 檢出限的考察

2.4 準(zhǔn)確度

在18F-FDG供試品溶液中，分別加入等體積的濃度為25、50、100和200 μg/mL氨基聚醚（2.2.2）溶液，均顯深藍(lán)色斑點(diǎn)，且隨濃度的升高，顏色加深；且與氨基聚醚（2.2.2）相應(yīng)濃度的斑點(diǎn)顏色基本一致（圖4）。

圖4 準(zhǔn)確度的考察

2.5 硅膠板的選擇

載體為玻璃或塑料材質(zhì)的硅膠G板均可滿足要求，塑料材質(zhì)的硅膠板輕便，容易剪裁，使用更方便。

2.6 18F-FDG注射液中氨基聚醚（2.2.2）的檢測(cè)

按照1.2實(shí)驗(yàn)方法，采用硅膠板2、3及4分別點(diǎn)樣，不同來(lái)源的31批次樣品中均未檢出氨基聚醚（2.2.2）。供試品溶液的典型檢測(cè)斑點(diǎn)圖見(jiàn)圖5。

圖5 18F-FDG供試品溶液氨基聚醚（2.2.2）檢測(cè)結(jié)果圖

2.7 18F-FES注射液和18F-FLT注射液中氨基聚醚（2.2.2）的檢測(cè)

將18F-FES注射液和18F-FLT注射液樣品點(diǎn)于薄層板上，均未顯色，說(shuō)明樣品無(wú)干擾。由于18F-FES注射液和18F-FLT注射液的基質(zhì)為10%乙醇溶液，按照1.2實(shí)驗(yàn)方法，將“限度對(duì)照溶液”中的純水替換成10%乙醇溶液。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。說(shuō)明本方法適用于18F-FES注射液和18F-FLT注射液中氨基聚醚（2.2.2）的檢測(cè)。

圖6 18F-FES注射液和18F-FLT注射液氨基聚醚（2.2.2）檢測(cè)結(jié)果圖

3 討 論

正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（positronemission tomography，PET）是最為靈敏的分子影像技術(shù)，其中的PET/CT融機(jī)體功能代謝影像和解剖結(jié)構(gòu)影像技術(shù)為一體，在腫瘤、心臟及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的診斷和療效評(píng)價(jià)等方面具有重要的臨床價(jià)值。目前還出現(xiàn)了PET/MR這一設(shè)備。隨著PET成功國(guó)產(chǎn)化，國(guó)家規(guī)劃正電子發(fā)射斷層顯像設(shè)備（包含PET）在2020年將達(dá)到743臺(tái)，因此PET檢查將進(jìn)一步大眾化。PET檢查中患者需要靜脈注射正電子藥物。目前，臨床上使用最廣泛的正電子類藥物是18F標(biāo)記的正電子藥物，其質(zhì)量直接關(guān)系到患者的安全和檢查質(zhì)量。

氨基聚醚（2.2.2）是18F標(biāo)記正電子藥物制備中最常用的催化劑，具有一定的毒性，其殘留量必須受到控制。由于以往檢測(cè)方法的局限性，《正電子類放射性藥品質(zhì)量控制指導(dǎo)原則》將氨基聚醚（2.2.2）檢查列入追溯性檢驗(yàn)項(xiàng)目，即在藥品使用之后再進(jìn)行檢驗(yàn)，因此存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。本研究建立的方法操作簡(jiǎn)單、快速和靈敏，可以實(shí)現(xiàn)藥品使用前完成氨基聚醚（2.2.2）含量檢測(cè)，從而更好地保障藥品質(zhì)量。

本研究檢測(cè)方法的反應(yīng)原理為氯鉑酸與碘化鉀反應(yīng)生成碘鉑酸，氨基聚醚（2.2.2）上的兩個(gè)氮與碘鉑酸發(fā)生螯合反應(yīng)而顯深藍(lán)色，隨著氨基聚醚（2.2.2）濃度的加大，深藍(lán)色加深。若供試品中含有叔氨基時(shí)也有可能顯色，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。但從18F-FDG注射液的現(xiàn)有合成工藝分析，其并不含有叔氨基結(jié)構(gòu)，即不會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。經(jīng)過(guò)對(duì)全國(guó)數(shù)十家醫(yī)療機(jī)構(gòu)18F-FDG注射液的檢測(cè)，目前尚未發(fā)現(xiàn)干擾。通過(guò)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本方法同樣適用于18F-FES注射液和18F-FLT注射液的檢測(cè)。對(duì)于其他含18F的正電子藥物，若是結(jié)構(gòu)中含有叔氨基，應(yīng)對(duì)其是否干擾檢測(cè)進(jìn)行考察以排除樣品的干擾；若是結(jié)構(gòu)中不含有叔氨基，可以嘗試使用本方法進(jìn)行氨基聚醚（2.2.2）檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)。

本研究發(fā)展了一種簡(jiǎn)單、快速和靈敏的氨基聚醚（2.2.2）檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了18F標(biāo)記正電子藥物在使用前完成氨基聚醚（2.2.2）檢測(cè)的目標(biāo)，可望保障正電子藥品的質(zhì)量和安全。