Hepcidin蛋白與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系

蔣舒娜，蔣麗娟，邵小南

（江蘇省常州市第一人民醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科，2.核醫(yī)學(xué)科，江蘇 常州 213003）

最新的癌癥統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，乳腺癌占女性新發(fā)癌癥的15%，在30～59歲女性中，乳腺癌是最常見的癌癥，乳腺癌是45歲以上女性癌癥死亡的主要原因，其次是肺癌。中國近幾十年來肥胖和缺乏活動發(fā)生率增加，可能是影響乳腺癌發(fā)病率的主要原因[1]。在晚期乳腺癌中，骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為65%～75%，而首發(fā)癥狀為骨轉(zhuǎn)移者占27%～50%[2]。

ORLANDI等[3]發(fā)現(xiàn)，相對于健康對照組，乳腺惡性腫瘤和乳腺良性病變患者的Hepcidin均增高。CINISELLI等[4]也發(fā)現(xiàn)，與良性乳腺疾病比較，乳腺癌的Hepcidin明顯升高，證實(shí)了Hepcidin在乳腺癌診斷的潛在作用。然而，Hepcidin與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究較少。本研究通過分析乳腺癌及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的Hepcidin、骨形態(tài)發(fā)生蛋白6（bone morphogenetic protein 6, BMP-6）、白細(xì)胞介素 6（Interleukin 6, IL-6）、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（human soluble transferrin receptor,sTfR）及血紅蛋白（Hemoglobin, Hb）等相關(guān)指標(biāo)，探討Hepcidin在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以指導(dǎo)臨床決策。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013年6月—2014年3月江蘇省常州市第一人民醫(yī)院乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者25例，乳腺癌無骨轉(zhuǎn)移患者30例及乳腺增生患者30例。3組患者年齡匹配，年齡55～75歲，平均66歲。所有患者均經(jīng)手術(shù)或病理確診，所有乳腺癌患者均經(jīng)過放射性核素掃描（ECT）初篩，并X射線、CT或MRI明確有無骨轉(zhuǎn)移。排除影響因素：骨代謝疾病、急性炎癥反應(yīng)（CRP＞6 mg/L）、肝功能異常（凝血酶原時間和谷丙轉(zhuǎn)氨酶異常）及心肺疾病病史。

1.2 試劑及儀器

Sysmex XE2100血細(xì)胞分析儀及試劑購自日本Sysmex公司，血清Hepcidin、BMP-6、IL-6及sTfR檢測試劑盒購自美國R&D公司，酶標(biāo)儀、洗板機(jī)購自美國Biorad公司。

1.3 血常規(guī)、血清Hepcidin、BMP-6、IL-6、sTfR的檢測

隔夜空腹，于8∶00～10∶00收集血樣，防止Hepcidin的晝夜波動[5]，分別注入EDTA抗凝管（2 ml）和血清管（3 ml）。血常規(guī)在2 h內(nèi)檢測；血清管3 000 r/min離心30 min分離血清，置入-80℃冰箱冷凍保存。按試劑盒說明書操作，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）分別檢測血清標(biāo)本中Hepcidin、BMP-6、IL-6、sTfR的含量（Hepcidin檢測范圍15.6～1 000 pg/ml，BMP-6檢測范圍156.00～10 000 pg/ml，IL-6檢測范圍3.1～300 pg/ml，sTfR檢測范圍3.0～80 nmol/L）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，各組數(shù)據(jù)做正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊的數(shù)據(jù)比較用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；ROC曲線比較各指標(biāo)對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷價值，多因素Logistic回歸分析比較各指標(biāo)在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者年齡、Hepcidin、IL-6、Hb、BMP-6、sTfR比較

3組患者平均年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3組患者 Hepcidin、IL-6、Hb、BMP-6、sTfR比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 3組患者年齡、Hepcidin、IL-6、Hb、BMP-6、sTfR的比較 （±s）

表1 3組患者年齡、Hepcidin、IL-6、Hb、BMP-6、sTfR的比較 （±s）

注：3組患者Hepcidin、IL-6、Hb比較采用單因素方差分析，BMP-6、sTfR因不符合方差齊性，采用非參數(shù)檢驗(yàn)

組別 n 年 齡 /歲 Hepcidin/（pg/ml） IL-6/（pg/ml） Hb/（g/L） BMP-6/（pg/ml） sTfR/（nmol/L）乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組 25 65.2±7.8 86.37±16.30 17.45±5.42 110.58±20.13 498.40±193.77 5.03±0.69乳腺癌無骨轉(zhuǎn)移組 30 63.6±9.7 47.21±18.48 12.13±6.36 132.44±17.78 335.26±179.83 7.21±0.70乳腺增生組 30 62.7±8.9 34.31±16.79 10.80±5.92 149.96±14.09 309.13±35.85 7.80±5.35 F/H值 0.161 65.733 9.313 35.185 15.632 26.411 P值 0.851 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3組患者Hepcidin、IL-6及Hb比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，對Hepcidin，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組＞乳腺癌無骨轉(zhuǎn)移組＞乳腺增生組；對IL-6，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組＞乳腺癌無骨轉(zhuǎn)移組及乳腺增生組，但乳腺癌無骨轉(zhuǎn)移組與乳腺增生組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.834，P=0.406）；對Hb，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組＜乳腺癌無骨轉(zhuǎn)移組＜乳腺增生組。

3組患者BMP-6、sTfR比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對BMP-6，根據(jù)平均秩次（59.08 VS 38.77 VS 33.83），乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組＞乳腺癌無骨轉(zhuǎn)移組＞乳腺增生組；對sTfR，根據(jù)平均秩次（23.50 VS 44.52 VS 57.73），乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組＜乳腺癌無骨轉(zhuǎn)移組＜乳腺增生組。見圖1、2。

2.2 Hepcidin、BMP-6、IL-6對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷價值

Hepcidin、BMP-6、IL-6對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷ROC曲線見圖3，各項參數(shù)見表2，Hepcidin用于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷價值最高。

2.3 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響因素

以乳腺癌是否骨轉(zhuǎn)移為應(yīng)變量（骨轉(zhuǎn)移Y=1，無骨轉(zhuǎn)移Y=0），Hepcidin、BMP-6、IL-6、sTfR及Hb賦值后為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。在回歸方程中有意義的指標(biāo)有兩項，為Hepcidin和sTfR；Hepcidin為骨轉(zhuǎn)移危險因素，sTfR為保護(hù)因素。主要影響因素結(jié)果見表3。

圖2 3組患者的sTfR比較 （±s）

圖3 Hepcidin、BMP-6、IL-6用于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移診斷的ROC曲線

表2 Hepcidin、BMP-6、IL-6用于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移診斷的各項參數(shù)

表3 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移多因素Logistic回歸分析參數(shù)

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，Hepcidin升高與多種癌癥有關(guān)，如多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、腎細(xì)胞癌[6-9]。PINNIX等[10]的研究突出了膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FPN）和Hepcidin在乳腺癌細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)失衡起重要作用。這些作者第一次表明，在培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞，Hepcidin通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制負(fù)調(diào)控FPN表達(dá)；此外，在腫瘤細(xì)胞中的Hepcidin濃度高于正常細(xì)胞。近期的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者與健康對照組比較，血漿Hepcidin濃度更高[3，11]，Hepcidin可以負(fù)性調(diào)節(jié)癌細(xì)胞FPN的表達(dá)。CINISELLI等[4]也發(fā)現(xiàn)，與良性乳腺疾病相比，乳腺癌的Hepcidin明顯升高。本組資料中，乳腺癌患者無論有無骨轉(zhuǎn)移，Hepcidin水平均高于乳腺增生組，與上述觀點(diǎn)相符。

為什么乳腺癌患者血漿Hepcidin升高？由鐵狀態(tài)、促紅細(xì)胞生成活性、炎癥，以及每個獨(dú)立信號的相對強(qiáng)度形成相互作用的通路來決定肝臟Hepcidin表達(dá)上調(diào)（包括BMP-6/SMAD4通路和IL-6/ STAT3通路）[3]。Hepcidin升高可能是由于炎癥刺激或腫瘤分泌物IL-6升高了血清鐵或依賴BMPs提供的信號。機(jī)制研究也發(fā)現(xiàn)，增加鐵、BMP-6和IL-6能共同促進(jìn)肝臟Hepcidin的合成[11]。

BMP-6是BMPs家族成員，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β。BMP已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與多種癌癥如乳腺癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤和卵巢癌相關(guān)。特別是多發(fā)性骨髓瘤的血清BMP-2水平會升高[7]。先前研究已經(jīng)表明，BMP-6在原發(fā)性乳腺癌標(biāo)本和細(xì)胞株表達(dá)，是癌細(xì)胞生長和遷移的抑制劑[12]。本組資料中，乳腺癌BMP-6水平高于乳腺增生組，且有骨轉(zhuǎn)移組更高，說明BMP-6不僅與乳腺疾病的良惡性相關(guān)，與骨轉(zhuǎn)移也有很大關(guān)系。

IL-6作為細(xì)胞因子的核心成員，由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，對腫瘤細(xì)胞的增殖有重要影響。楊士軍等[13]的研究結(jié)果顯示，IL-6在健康對照組和無骨轉(zhuǎn)移組患者血清中都具有一定水平，但都沒有超過150 pg/ml（試劑盒提供的正常上限），而骨轉(zhuǎn)移組患者血清IL-6水平明顯高于無骨轉(zhuǎn)移組和健康對照組，推測轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞自身產(chǎn)生IL-6，提示IL-6參與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的病理過程。本組資料中，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組IL-6高于無骨轉(zhuǎn)移組和乳腺增生組，支持上述觀點(diǎn)。

在晚期乳腺癌中，骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為65%～75%[14-15]，而首發(fā)癥狀為骨轉(zhuǎn)移者占27%～50%，一旦發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，疾病進(jìn)入不可治愈的階段，因此骨轉(zhuǎn)移決定乳腺癌患者的預(yù)后。薛東等[16]發(fā)現(xiàn)血清Hepcidin可以作為診斷前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的敏感指標(biāo)，同時可以作為預(yù)后隨訪指標(biāo)，判斷治療療效。PINNIX等[10]也發(fā)現(xiàn)在乳腺癌人群中伴隨高FPN和低Hepcidin表達(dá)的患者預(yù)后較好，95%存活5年無復(fù)發(fā)。相反，高Hepcidin表達(dá)與預(yù)后差相關(guān)，較低的腫瘤FPN水平也有類似結(jié)果。Pinnix用無轉(zhuǎn)移生存率的多因素分析證實(shí)了FPN和Hepcidin獨(dú)立的預(yù)后價值。

然而，國內(nèi)外缺乏對Hepcidin與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的直接研究。楊士軍等[13]發(fā)現(xiàn)IL-6與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)。本組資料ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)Hepcidin對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移診斷有較高的價值，且優(yōu)于BMP-6及IL-6。進(jìn)一步多因素分析結(jié)果，Hepcidin為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移危險因素，sTfR為保護(hù)因素。上述結(jié)果證實(shí)Hepcidn不僅可以診斷乳腺癌骨轉(zhuǎn)移，還可以作為乳腺癌預(yù)后隨訪指標(biāo)。通過BMP-6拮抗劑和IL-6單抗能降低Hepcidin的表達(dá)，也許可作為治療手段，改善體內(nèi)微炎癥狀態(tài)和鐵代謝，延緩乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的進(jìn)展，糾正腫瘤晚期貧血[17]。

綜上所述，Hepcidin與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移有較好的相關(guān)性，但由于本研究為小樣本回顧性研究，其診斷價值還需要進(jìn)一步研究。同時期待Hepcidin對于乳腺癌及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移有潛在的治療價值。