NKp44+NK細(xì)胞在1型糖尿病患者外周血中的表達(dá)*

薛君力，李蘭芳，李琳蕓，曾姣娥，張娟

（湖北省荊州市中心醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科，2.檢驗(yàn)科，湖北 荊州 434020）

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus, T1DM）是自身免疫性疾病[1]，其主要與T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞等作用相關(guān)[2-3]。表達(dá)自然殺傷組2D+（natural killer group 2D, NKG2D+）等受體的NK細(xì)胞與1型糖尿病發(fā)生相關(guān)[4-7]。表達(dá)NKp44+受體的自然殺傷（natural killer, NK）細(xì)胞最早發(fā)現(xiàn)于扁桃體腺，主要分泌白細(xì)胞介素22（Interleukin-22, IL-22）等炎癥因子[8]。IL-22與1型糖尿病發(fā)生密切相關(guān)[9]。NKp44+NK細(xì)胞是IL-22的重要分泌細(xì)胞，其也可能與1型糖尿病發(fā)病密切相關(guān)，本研究擬通過(guò)檢測(cè)1型糖尿病患者外周血中的NKp44+NK細(xì)胞及IL-22表達(dá)，探討其與1型糖尿病發(fā)生的可能相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年6月—2015年12月湖北省荊州市中心醫(yī)院就診的1型糖尿病患者19例。其中，男性12例，女性7例；平均年齡（34±13）歲。募集年齡及性別相匹配的健康對(duì)照組20例。其中，男性13例，女性7例；平均年齡（32±13）歲。兩組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。1型糖尿病依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)2013年版《中國(guó)1型糖尿病診治指南》診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)生酮癥酸中毒未行糾正者；急慢性感染；嚴(yán)重的器官損害：肝、腎、心血管及肺部；嚴(yán)重的精神病患者；妊娠者。本研究獲該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有受試者均獲得知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)生化指標(biāo)及糖尿病慢性并發(fā)癥篩查 兩組均在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽血采血，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血胱抑素c、促甲狀腺激素及血脂（三酰甘油、膽固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白）等指標(biāo)。高壓液相法檢測(cè)糖化血紅蛋白，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)谷氨酸脫羧酶抗體及胰島素相關(guān)抗體，放射免疫法檢測(cè)空腹C肽。糖尿病腎臟病變、糖尿病周圍神經(jīng)病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變及糖尿病下肢動(dòng)脈病變?cè)\斷均參照2013年版中國(guó)2型糖尿病防治指南。

1.2.2 IL-22檢測(cè) 采用ELISA檢測(cè)試劑盒（BMS2047 eBioscience奧地利賽默飛公司）檢測(cè)血清中IL-22水平。利用試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后檢測(cè)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。將獲得的血清標(biāo)本按ELISA試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行檢測(cè)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中IL-22濃度。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)NKp44+NK細(xì)胞 取受試者血液100 μl，分別依次加入PE-CD336（NKp44+）10 μl（IM3710 clone Z231，法國(guó)貝克曼公司）、ECDCD3 5μl（IM2705U clone UCHT1，法國(guó)貝克曼公司）及PC5-CD56 5μl（A07789 clone N901，法國(guó)貝克曼公司），同時(shí)每管加好同型對(duì)照（法國(guó)貝克曼公司）減少由于抗體非特異性結(jié)合所致的背景染色。室溫避光孵育30 min，加入紅細(xì)胞溶解液0.5 ml，迅速混勻，室溫避光孵育10 min，室溫3 000 r/min，離心5 min，去除上清 ，加入1.5 ml磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline, PBS）重懸細(xì)胞，室溫3 000 r/min，離心5 min，移去上清液，加入300μl PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀（法國(guó)貝克曼公司）檢測(cè)NKp44+細(xì)胞比例。NKp44+NK細(xì)胞表面標(biāo)記定義為CD3-CD56+NKp44+。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。正態(tài)分布的兩變量相關(guān)分析采用Pearson分析，偏態(tài)分布變量采用Spearman分析。非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 1型糖尿病患者NKp44+NK細(xì)胞比例及IL-22表達(dá)

外周血中NKp44+NK細(xì)胞占外周血有核細(xì)胞比例，在1型糖尿病患者中為（0.030±0.018）%，而在對(duì)照組中的比例為（0.001±0.001）%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.285，P=0.000）（見(jiàn)圖 1）。1型糖尿病患者外周血中IL-22濃度與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.097，P=0.000），1型糖尿病患者IL-22濃度（48.598±10.672）pg/ml較對(duì)照組IL-22濃度（35.847±7.923）pg/ml升高。

2.2 1型糖尿病患者中NKp44+NK細(xì)胞比例與IL-22相關(guān)性分析

1型糖尿病患者外周血中IL-22濃度與NKp44+NK細(xì)胞比例呈正相關(guān)（r=0.513，P=0.025）。見(jiàn)圖2。

2.3 1型糖尿病患者NKp44+NK細(xì)胞比例及IL-22與患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)間的相關(guān)分析

利用相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)1型糖尿病患者外周血中IL-22、NKp44+NK細(xì)胞比例與年齡、病程、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、谷氨酸脫羧酶抗體、胰島素相關(guān)抗體、胰島素生長(zhǎng)樣因子、胱抑素c、促甲狀腺激素、三酰甘油、膽固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白等均無(wú)相關(guān)；NKp44+NK細(xì)胞比例與糖化血紅蛋白相關(guān)（r=0.465，P=0.045）。見(jiàn)表 1。

圖1 1型糖尿病患者及對(duì)照組外周血NKp44+NK流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

圖2 NKp44+NK細(xì)胞比例與IL-22相關(guān)性分析

2.4 1型糖尿病患者NKp44+NK細(xì)胞及IL-22與糖尿病慢性并發(fā)癥的關(guān)系

表1 1型糖尿病患者資料及相關(guān)性分析

對(duì)于1型糖尿病以有無(wú)糖尿病下肢動(dòng)脈病變、糖尿病腎臟病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變及糖尿病周圍神經(jīng)病變等并發(fā)癥進(jìn)行分類，分析各患者間NKp44+NK細(xì)胞比例及IL-22表達(dá)差異。結(jié)果顯示在無(wú)糖尿病周圍神經(jīng)病變患者NKp44+NK細(xì)胞比例較糖尿病周圍神經(jīng)病變患者升高（t=2.970，P=0.009），NKp44+NK細(xì)胞比例在有無(wú)糖尿病下肢動(dòng)脈病變、糖尿病腎臟病變及糖尿病視網(wǎng)膜病變患者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表2）。IL-22表達(dá)在有無(wú)糖尿病下肢動(dòng)脈病變、糖尿病腎臟病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變及糖尿病周圍神經(jīng)病變患者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表3）。

表2 1型糖尿病患者NKp44+NK細(xì)胞比例與慢性并發(fā)癥的關(guān)系 （%，±s）

表2 1型糖尿病患者NKp44+NK細(xì)胞比例與慢性并發(fā)癥的關(guān)系 （%，±s）

并發(fā)癥 糖尿病腎臟病變 糖尿病視網(wǎng)膜病變 糖尿病周圍神經(jīng)病變 糖尿病下肢動(dòng)脈病變有0.029±0.018（n =6） 0.029±0.011（n =8） 0.018±0.005（n =5） 0.025±0.007（n =2）無(wú)0.033±0.019（n =13） 0.032±0.023（n =11） 0.034±0.019（n =14） 0.031±0.019（n =17）t值 0.539 0.365 2.970 0.407 P值 0.597 0.720 0.009 0.689

表3 1型糖尿病患者IL-22表達(dá)與慢性并發(fā)癥的關(guān)系 （%，±s）

表3 1型糖尿病患者IL-22表達(dá)與慢性并發(fā)癥的關(guān)系 （%，±s）

并發(fā)癥 糖尿病腎臟病變 糖尿病視網(wǎng)膜病變 糖尿病周圍神經(jīng)病變 糖尿病下肢動(dòng)脈病變有52.759±10.910（n =6） 50.041±11.692（n =8） 45.933±8.790（n =5） 45.884±19.167（n =2）無(wú)46.036±10.421（n =13） 47.581±10.875（n =11） 49.550±11.412（n =14） 48.923±10.214（n =17）t值 1.166 0.461 0.640 0.371 P值 0.260 0.651 0.531 0.715

3 討論

NKp44+NK細(xì)胞以其表面表達(dá)的細(xì)胞毒性受體命名的一類NK細(xì)胞，屬于CD56bright NK細(xì)胞亞類，表面表達(dá)趨化因子受體6（chemokine receptor 6, CCR6）、CD96和CD103等多種趨化因子受體，并分泌IL-22、IL-26及白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）等黏膜免疫相關(guān)分子[8]。研究證實(shí)，NKp44+NK細(xì)胞在強(qiáng)直性脊柱炎[10]及原發(fā)性干燥綜合征[11]等自身免疫性疾病表達(dá)升高。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血中NKp44+NK細(xì)胞比例增加，并通過(guò)IL-22調(diào)控滑膜細(xì)胞增殖來(lái)參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生[12]，本研究也證實(shí)另一類自身免疫性疾病1型糖尿病患者中NKp44+NK細(xì)胞及IL-22表達(dá)升高。

1型糖尿病以胰島β細(xì)胞破壞為主的自身免疫性疾病，其發(fā)病與人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）復(fù)合物等遺傳背景密切相關(guān)[13]，但是導(dǎo)致1型糖尿病發(fā)生的啟動(dòng)因素目前仍未明確，可能包括病毒（腸道病毒、柯薩奇病毒、先天性風(fēng)疹等）、環(huán)境毒素（亞硝胺類）及食物（早期暴露的牛奶、谷物、麩質(zhì)等）等[14-15]。NK細(xì)胞與這些始動(dòng)因素相關(guān)，非肥胖型小鼠模型中胰島β細(xì)胞破壞與病毒感染所致NK細(xì)胞依賴的細(xì)胞凋亡有關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病患者外周血中NKp44+NK細(xì)胞比例增加，同時(shí)IL-22水平明顯升高，IL-22可來(lái)源于NKp44+NK細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Th22細(xì)胞及LTi細(xì)胞等細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)IL-22與NKp44+NK細(xì)胞呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)NKp44+NK細(xì)胞是外周血中IL-22水平升高的重要來(lái)源之一[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，NKp44+NK細(xì)胞與糖化血紅蛋白呈正相關(guān)，提示NKp44+NK細(xì)胞可能與血糖控制欠佳有關(guān)。NKp44+NK細(xì)胞與免疫損傷相關(guān)[12]，但本研究并未發(fā)現(xiàn)NKp44+NK細(xì)胞及IL-22與胰島β細(xì)胞破壞相關(guān)的谷氨酸脫羧酶抗體及胰島素相關(guān)抗體等指標(biāo)相關(guān)，可能與NKp44+NK細(xì)胞主要參與了細(xì)胞免疫調(diào)控有關(guān)[8]。本研究未分析NKp44+NK細(xì)胞及IL-22與胰島功能指標(biāo)空腹C肽的相關(guān)性，其原因與本研究采用的C肽檢測(cè)試劑盒檢測(cè)敏感性有關(guān)，其C肽下限位于0.01 ng/dl，本研究納入受試者C肽水平均低于下限值，C肽均無(wú)具體數(shù)值，因此缺乏相關(guān)性分析。

NKp44+NK細(xì)胞與糖尿病慢性并發(fā)癥相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NKp44+NK細(xì)胞主要與糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)。在合并周圍神經(jīng)病變組中NKp44+NK細(xì)胞在外周血有核細(xì)胞中比例下降。現(xiàn)關(guān)于NKp44+NK細(xì)胞與糖尿病慢性并發(fā)癥尤其是周圍神經(jīng)病變的相關(guān)性研究尚欠佳。增高的氧化應(yīng)激水平是糖尿病周圍神經(jīng)發(fā)病的重要機(jī)制[17]，在終末期腎病患者中氧化應(yīng)激能夠減少NK細(xì)胞活化受體的表達(dá)NKG2D[18]，推測(cè)1型糖尿病患者周圍神經(jīng)病變NKp44+NK細(xì)胞表達(dá)下調(diào)可能也與氧化應(yīng)激有關(guān)。NK細(xì)胞能夠增加熱痛的閾值[19]，合并糖尿病周圍神經(jīng)病變患者NKp44+NK細(xì)胞下降可能減少閾值來(lái)參與1型糖尿病患者周圍神經(jīng)病變發(fā)生，但均需進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，目前發(fā)現(xiàn)在1型糖尿病患者外周血中NKp44+NK細(xì)胞比例增多，其可能通過(guò)增加IL-22的分泌來(lái)參與1型糖尿病發(fā)病，雖然納入本研究的樣本量偏少，可能會(huì)對(duì)本研究的結(jié)果產(chǎn)生一定程度的影響，但是對(duì)于明確1型糖尿病發(fā)病機(jī)制仍具有參考意義。