肝癌中骨形態(tài)發(fā)生蛋白7表達(dá)及其與生存相關(guān)性分析*

李鍇，宋燕州，李偉

（江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院 普通外科，江蘇 連云港 222000）

世界范圍內(nèi)的肝細(xì)胞肝癌發(fā)生率逐年增加，已經(jīng)成為腫瘤死亡的第3位[1]。大多數(shù)肝癌患者的預(yù)后非常差，每年新診斷患者數(shù)接近每年死亡的數(shù)量[2]。這一可怕局面源于缺乏早期診斷、大多數(shù)可發(fā)展為肝癌的肝硬化惡化以及肝癌化療的高耐藥性[3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor, TGF）在肝纖維化及肝硬化中起到重要作用，作為超家族成員中最大的一族，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）具有抗纖維化作用，在細(xì)胞的增殖、分化及凋亡中扮演著重要的角色。既往已經(jīng)在體外經(jīng)過分子、細(xì)胞水平驗(yàn)證BMP-7在肝癌相關(guān)細(xì)胞中發(fā)揮促生成作用[4-5]，但BMP-7在肝癌組織中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系尚未見諸報(bào)導(dǎo)，本研究旨在揭示BMP-7在不同肝臟組織中的表達(dá)，并探究其與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系，為進(jìn)一步研究肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

兔抗人多克隆BMP-7抗體（美國(guó)Proteintech公司），DAB顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）、即用型免疫組織化學(xué)EliVision plus試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），SYBR PCR試劑盒（日本TaKaRa生物工程公司）。UV分光光度計(jì)（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)資料 于連云港市第一人民醫(yī)院生物標(biāo)本庫(kù)中取得2010年1月—2013年12月間手術(shù)切除的肝癌組織85例及20例癌旁組織標(biāo)本（距腫瘤邊緣1 cm），以肝血管瘤及肝臟外傷患者14例手術(shù)標(biāo)本作為良性對(duì)照。上述組織術(shù)后均經(jīng)病理檢測(cè)證實(shí)其診斷。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 按說明書基本操作流程操作，BMP-7一抗加入PBS稀釋濃度為1∶200，BMP-7二抗用PBS稀釋為1∶6。

1.2.3 肝臟組織總RNA的提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 依據(jù)說明書逐步提取肝臟組織總RNA，通過UV分光光度計(jì)檢測(cè)在260和280 nm波長(zhǎng)處的吸光度后置入-80℃冰箱冷凍保存。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（20 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系）。實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, real-time RT-PCR），以β-actin作為內(nèi)參，25 μl反應(yīng)體系（包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μl，2×PCR反應(yīng)mix 12.5 μl，正向引物 1 μl，反向引物 1 μl，dH2O 9.5 μl），反應(yīng)條件 ：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火及延伸30 s，共持續(xù)35個(gè)循環(huán)。

1.3 肝癌組織、癌旁組織及非癌肝臟組織BMP-7免疫組織化學(xué)檢測(cè)

對(duì)應(yīng)生物標(biāo)本庫(kù)中所取患者信息，選取相應(yīng)肝癌組織石蠟標(biāo)本、癌旁組織石蠟標(biāo)本及非癌肝臟組織石蠟標(biāo)本，上述組織術(shù)后均經(jīng)病理檢測(cè)證實(shí)其診斷。對(duì)肝癌組織、癌旁組織及非癌肝臟組織BMP-7進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，石蠟切片脫蠟、水化、微波抗原修復(fù)，3%過氧化氫除去內(nèi)源性過氧化物酶，BMP-7免疫組織化學(xué)檢測(cè)按試劑盒說明書進(jìn)行，DAB染色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇一二甲苯脫水，封片。顯微鏡下觀察，胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為免疫組織化學(xué)染色BMP-7陽(yáng)性細(xì)胞。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

按細(xì)胞胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)，每張切片光學(xué)顯微鏡下查看5個(gè)隨機(jī)的視野（400倍），再用隨機(jī)的方法選擇200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算BMP-7表現(xiàn)陽(yáng)性的百分比，取均值；BMP-7陽(yáng)性細(xì)胞≥10%判定為組織BMP-7陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用例表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，應(yīng)用Kaplan-Meier生存法統(tǒng)計(jì)繪制BMP-7陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者生存曲線，Logrank檢驗(yàn)比較BMP-7表達(dá)對(duì)肝癌患者遠(yuǎn)期生存率的影響，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMP-7在肝癌組織、癌旁組織、非癌肝臟組織中的表達(dá)

肝癌組織中BMP-7陽(yáng)性率為77.6%，癌旁組織中BMP-7陽(yáng)性率為55.0%，非癌肝臟組織BMP-7陽(yáng)性率為35.7%，BMP-7在3種組織中表達(dá)的陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.035，P=0.002）（見表1）。肝癌組織中BMP-7表達(dá)高于癌旁組織及非癌肝臟組織，且陽(yáng)性率從非癌肝臟組織、癌旁組織到肝癌組織呈現(xiàn)遞減現(xiàn)象。

肝癌組織、癌旁組織及非癌肝臟組織BMP-7的表達(dá)見圖1。肝癌組織陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)為（173.6±20.4）個(gè)，癌旁組織（65.4±36.9），非癌肝臟組織（29.4±7.8）個(gè)，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=365.016，P=0.000），各組BMP-7表達(dá)的水平有差異；與肝癌組織比較，癌旁組織及非癌肝臟組織中可見BMP-7陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)較少，進(jìn)一步兩兩比較顯示，與癌旁組織比較，肝癌組織中BMP-7陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)增多（q=26.714，P=0.042）；與非癌肝臟組織比較，肝癌組織中BMP-7陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)增多（q=30.677，P=0.021）。BMP-7在肝癌組織、癌旁組織、非癌肝臟組織中的表達(dá)分別為（2.213±0.210）、（1.126±0.182）及（0.786±0.319），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=392.607，P=0.000），各組BMP-7的表達(dá)水平有差異；進(jìn)一步兩兩比較顯示，肝癌組織中BMP-7相對(duì)表達(dá)量較癌旁組織增高（q=3.361，P=0.019）；肝癌組織中BMP-7相對(duì)表達(dá)量較非癌肝臟組織增高（q=2.805，P=0.032）（見圖 2）。

表1 BMP-7在肝癌組織、癌旁組織及非癌肝臟組織中的表達(dá)情況 例（%）

圖1 BMP-7在不同組織中的表達(dá) （免疫組織化學(xué)法×400）

2.2 BMP-7與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

與BMP-7陰性組織比較，BMP-7陽(yáng)性組織的腫瘤直徑、分化程度及2年生存率的比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組織分型上，低、未分化組織BMP-7陽(yáng)性表達(dá)較中、高分化組織高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。性別、年齡及術(shù)后腫瘤是否復(fù)發(fā)的BMP-7表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖2 BMP-7在肝癌組織、癌旁組織、非癌肝臟組織中的表達(dá)

2.3 BMP-7在肝癌的表達(dá)與患者預(yù)后生存之間的關(guān)系

與BMP-7陰性表達(dá)患者比較，BMP-7陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存率降低（χ2=8.132，P=0.004）。見圖3。

表2 BMP-7表達(dá)與肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系

續(xù)表2

圖3 BMP-7陽(yáng)性及陰性表達(dá)肝癌患者術(shù)后生存曲線圖

3 討論

作為TGF家族之一，BMP-7從人類血小板中第一次分離出來，同時(shí)發(fā)現(xiàn)它可以減少創(chuàng)傷的愈合時(shí)間[6]，繼而在乳腺癌、胃癌、腎癌、結(jié)直腸癌等許多腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的BMP-7[7-8]。許多相關(guān)研究指出，TGF-β作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族可以通過相關(guān)信號(hào)通路，在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、影響細(xì)胞發(fā)育、控制細(xì)胞分化等過程中發(fā)揮作用，BMP-7可以使前炎癥細(xì)胞因子水平下降；也可以促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的生成，以上等研究進(jìn)一步表明BMP-7可以使細(xì)胞的纖維化過程發(fā)生逆轉(zhuǎn)。

通過下調(diào)前炎癥因子及誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶等進(jìn)而逆轉(zhuǎn)組織細(xì)胞的纖維化[9]。BMP-7通過拮抗TGF-β/Smads信號(hào)通路在肝臟組織細(xì)胞的慢性纖維化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[10-11]。TGF-β可減弱上皮細(xì)胞的分裂增殖，以上也可以發(fā)生在免疫細(xì)胞中，抑制增殖的過程可以促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)肝臟細(xì)胞的可塑性變化、誘導(dǎo)產(chǎn)生肝癌細(xì)胞[12]。BMP-7可以阻抑TGF-β，BMP-7在細(xì)胞中表達(dá)水平的異?？赡芤种聘伟┘?xì)胞的分裂增殖，同時(shí)減弱肝癌細(xì)胞的相關(guān)功能。

本研究結(jié)果表明，BMP-7與肝癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，其在肝癌組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于癌旁組織、非癌肝臟組織，陽(yáng)性表達(dá)BMP-7的肝癌患者其表達(dá)水平與腫瘤大小、分化程度密切相關(guān)，且其預(yù)后較陰性表達(dá)者差，需進(jìn)一步深入的機(jī)制研究。抑制BMP-7的表達(dá)或可改善肝癌患者的術(shù)后生存狀況，檢測(cè)BMP-7的表達(dá)或可成為肝癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。