通精靈對精索靜脈曲張模型大鼠生精細(xì)胞凋亡及凋亡因子Cyt C、caspase-9的影響

劉冰崔云杜寶昕鄭軍狀李培輪劉擎任國慶方騰鐸

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬寧波中醫(yī)院3.重慶市中醫(yī)院 4.浙江慈溪市中醫(yī)醫(yī)院

精索靜脈曲張（aricocele，VC）是指精索內(nèi)蔓狀靜脈叢異常擴(kuò)張和彎曲，在正常人群中發(fā)病率約為15%，其中20%患者伴有生育問題[1-3]。VC與男性生育能力關(guān)系密切，是男性不育的重要原因之一，但其具體機(jī)制尚未明確。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，VC可導(dǎo)致睪丸組織病理損傷，生精細(xì)胞過度凋亡，從而引起精子數(shù)量減少和活力減弱，影響男性生育能力[4-6]。生精細(xì)胞凋亡異?？赡苁荲C影響男性生育能力分子機(jī)制之一。中醫(yī)藥治療在治療精索靜脈曲張不育癥方面有其獨(dú)特優(yōu)勢，導(dǎo)師崔云教授為第六批全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師，崔師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)所創(chuàng)立的自擬方通精靈，切合本病病機(jī)，可有效提高VC致不育患者精子活力[7]。同時(shí)，本課題組前期研究初步發(fā)現(xiàn)，通精靈可有效降低VC模型大鼠睪丸生精細(xì)胞的凋亡指數(shù)，降低凋亡相關(guān)因子半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3，capase-3）的表達(dá)[8]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以Wistar大鼠建立實(shí)驗(yàn)性VC模型，觀察通精靈對睪丸組織形態(tài)影響，明確其對VC模型大鼠生精細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，并更進(jìn)一步檢測其對生精細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt C） 和半胱氨酸蛋白酶-9（cysteine aspartic acid specific protease-9，caspase-9）表達(dá)的影響，以更全面、系統(tǒng)地探討通精靈改善睪丸組織損傷、抑制生精細(xì)胞過度凋亡的作用機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)條件 雄性SPF級Wistar大鼠72只，3月齡，體質(zhì)量（350±20）g，采購于上海 BK 公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-0016]，委托浙江中醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184]。飼養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃，濕度 50%～70%，12h光暗循環(huán)，自由飲水、飲食，定期清潔消毒。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 EG1150H石蠟包埋機(jī)（德國Leica公司）；RM2235切片機(jī)（德國Leica公司）；HI1210烤片機(jī)（德國 Leica公司）；Nikon eclipse 80i顯微鏡（Nikon公司）；流式細(xì)胞儀（NovoCyte公司）；微量加樣器（Thermo公司）；QL-861型渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；D-37520臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher公司）；Thermo Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher公司）；Mini-Proten Tetra System電泳系統(tǒng)（Bio-rad公司）；ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀（Bio-rad公司）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑 TUNEL染色試劑盒購于南京建成生物工程研究所（批號：G001-1）；Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒購于Multi Sciences公司（批號：AP101）；BCA蛋白濃度測定試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品（批號：P0010）；Cyt C抗體購于CST公司（批號：#11940）；caspase-9抗體購于abcam公司（批號：ab32539）；ECL Plus發(fā)光試劑盒購于Bio-Rad公司（批號：#1705061）。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物 中藥復(fù)方通精靈由柴胡10g、丹參30g、紅花 6g、菟絲子 10g、五加皮 10g、枸杞子 10g、三七粉3g、炒露蜂房10g、煅龍骨30g、煅牡蠣30g等組成，將上述藥物放入高壓自動(dòng)煎藥機(jī)內(nèi)，加10倍量的水，115℃、0.10Mpa高溫高壓煎煮1h，將第1次水煎液倒出過濾，煎煮后的藥物再繼續(xù)加水，連續(xù)煎煮3次，將全部水煎液合并，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)，旋蒸濃縮為 1.6g、3.2、6.4g·mL-1的水煎劑，4℃冷藏備用。左卡尼汀口服液購于東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司（批號：#161153）。

1.5 方法

1.5.1 分組 依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組、模型組、通精靈低劑量組、通精靈中劑量組、通精靈高劑量組和左卡尼汀組，每組12只。

1.5.2 模型建立及給藥 參照相關(guān)文獻(xiàn)建立VC模型[9-10]。方法如下：大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，劑量40mg/kg，麻醉后于劍突下行腹部正中切口，將腹內(nèi)容物輕推向右上腹，于左側(cè)腹膜后顯露左腎靜脈，游離部分左腎靜脈，以一直徑0.8mm的光滑金屬探針置于左腎靜脈下一并結(jié)扎，結(jié)扎完成后小心抽出金屬探針，借此以使左腎靜脈部分復(fù)通，游離結(jié)扎左精索內(nèi)靜脈與左髂總靜脈的交通支。假手術(shù)組只行腎靜脈分離不結(jié)扎，左精索內(nèi)靜脈與左髂總靜脈的交通支只作游離不結(jié)扎，然后縫合腹壁。2周后，參考文獻(xiàn)[10]，采用“夾尾激怒法”建立中醫(yī)肝氣郁結(jié)、經(jīng)絡(luò)瘀阻、腎精不足的精索靜脈曲張大鼠模型。

造模4周后給藥，根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[11]，大鼠用藥劑量按照60kg成人用量的6.3倍進(jìn)行換算，換算后通精靈低、中、高劑量組分別予，1.6、3.2、6.4g·mL-1濃度的水煎液灌胃；左卡尼汀成人臨床用量為2g[12]，換算為大鼠用藥濃度為 0.021g·mL-1；假手術(shù)組及模型組大鼠均給予0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組灌胃體積均為1mL/100g體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)8周。

1.5.3 HE染色觀察睪丸組織形態(tài)學(xué) 給藥結(jié)束后，禁食不禁水12h，麻醉后分離各組大鼠左側(cè)睪丸組織，稱重后固定、脫水、石蠟包埋、切片，按HE染色步驟進(jìn)行染色，光鏡下觀察各組大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5.4 TUNEL法及Annexin V-FITC檢測睪丸生精細(xì)胞凋亡 取睪丸組織石蠟切片，按TUNEL染色試劑盒步驟檢測睪丸生精細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞核染為棕黃色，即為凋亡細(xì)胞。

睪丸生精細(xì)胞凋亡的檢測嚴(yán)格按照Annexin VFITC試劑盒步驟進(jìn)行操作，步驟如下：將0.9%氯化鈉溶液6mL預(yù)熱至37℃，取適量睪丸組織放入其中，剪碎并搖勻，以200目濾網(wǎng)過濾后計(jì)數(shù)生精細(xì)胞，以0.9%氯化鈉溶液將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整至2×106/mL備測。加入500μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，再分別加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的 PI，輕柔渦旋混勻后，避光室溫孵育5min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.5.5 Western blot法測大鼠睪丸組織中Cyt C和caspase-9蛋白表達(dá) 取大鼠睪丸組織50～100mg，PBS清洗2遍，加入蛋白裂解液，冰上研磨30s，靜置10min；4℃、13 000r/min 離心 30min，取上清液，重復(fù)1次；BCA法蛋白測定濃度；100℃沸水浴，滅活蛋白5min。在15%分離膠和5%濃縮膠上進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉；4℃一抗孵育過夜，洗膜3次，室溫孵育二抗2h、洗膜3次、ECL化學(xué)發(fā)光顯影，Imaege J灰度掃描。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。滿足方差齊性的計(jì)量資料，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊者，采用Dunnett T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠模型建立情況 在實(shí)驗(yàn)過程中，模型組2只大鼠術(shù)后不明原因死亡；通精靈中劑量組1只大鼠術(shù)后不明原因死亡、1只大鼠造模后精索靜脈曲張直徑小于0.5mm，沒有納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)；假手術(shù)組1只大鼠術(shù)后不明原因死亡；通精靈高劑量組1只大鼠因灌胃誤入肺中后死亡，故最終建模成功納入研究的動(dòng)物數(shù)量為66只。

2.2 各組大鼠睪丸組織形態(tài)觀察 光鏡下觀察可見，假手術(shù)組睪丸生精小管內(nèi)各級生精細(xì)胞排列整齊、致密，層次清楚，結(jié)構(gòu)正常。各級生精細(xì)胞發(fā)育良好，生精小管管腔內(nèi)可見大量精子。見圖1A。模型組睪丸生精小管內(nèi)生精細(xì)胞排列紊亂，層次減少，甚至全無。基底膜損傷、變薄，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞全部脫落，生精細(xì)胞脫落至生精小管管腔內(nèi)，可見管腔阻塞，管腔內(nèi)少見精子。見圖1B。通精靈低劑量組睪丸生精小管內(nèi)各級生精細(xì)胞排列仍較紊亂，層次較不明顯，部分生精小管腔內(nèi)仍可見大片脫落的生精細(xì)胞阻塞管腔，管腔內(nèi)可見少量精子。見圖1C。中劑量組中睪丸生精小管內(nèi)各級生精細(xì)胞排列整齊、致密，層次分明，生精細(xì)胞數(shù)量正常，管腔內(nèi)無脫落的生精細(xì)胞，其內(nèi)可見大量精子。見圖1D。高劑量組睪丸生精小管內(nèi)生精細(xì)胞按正常分化序列排列，層次較清楚，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，著色正常，精原細(xì)胞及其他各級生精細(xì)胞的數(shù)量輕度減少。見圖1E。左卡尼汀組睪丸生精小館內(nèi)各級生精細(xì)胞排列較整齊、稍疏松，層次較不明顯，極少數(shù)管腔內(nèi)有少量生精細(xì)胞脫落。各級生精細(xì)胞數(shù)量輕度減少，管腔內(nèi)可見少量精子。見圖1F。

2.3 各組大鼠睪丸組織生精細(xì)胞凋亡比較 TUNEL結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組睪丸生精細(xì)胞凋亡數(shù)目較多，各級生精細(xì)胞中均可見凋亡的生精細(xì)胞；通精靈各組及左卡尼汀組生精細(xì)胞凋亡的數(shù)目較少，其中通精靈中、高劑量組及左卡尼汀組凋亡生精細(xì)胞的數(shù)目明顯少于模型組，通精靈低劑量組凋亡的生精細(xì)胞略少于模型組，且各干預(yù)組凋亡的生精細(xì)胞多集中于靠近生精小管基底部的精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞處。見圖2。

Annexin V-FITC結(jié)果顯示，各組大鼠生精細(xì)胞凋亡率存在明顯差異。與假手術(shù)組比較，模型組生精細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；通精靈中、高劑量組及左卡尼汀組生精細(xì)胞凋亡率均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，通精靈低劑量組生精細(xì)胞凋亡率降低不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1。

圖1 各組大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)改變比較（HE染色，100×）Fig.1 Comparison of the morphological changes in the testis of rats in each group(HE staining,100×)

圖2 各組大鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡情況（DAB染色，400×）Fig.2 Apoptosis of spermatogenic cells of rat testis in each group(DAB staining,400×)

表1 各組大鼠生精細(xì)胞凋亡率比較（%）Tab.1 Comparison of the apoptosis rate of spermatogenic cells in each group(%)

2.4 各組大鼠睪丸組織中Cyt C、caspase-9蛋白表達(dá)比較 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組中大鼠睪丸組織中Cyt C、caspase-9蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，通精靈低劑量組中Cyt C、caspase-9蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；通精靈中、高劑量組Cyt C、caspase-9蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.01）；同時(shí)左卡尼汀組中Cyt C、caspase-9蛋白表達(dá)也減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。而且，通精靈高劑量組中Cyt C、caspase-9蛋白表達(dá)明顯少于左卡尼汀組（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3、4。

圖3 各組大鼠睪丸組織中Cyt C、caspase-9蛋白表達(dá)比較Fig.3 Comparison of expression of Cyt C and caspase-9 protein in testis of eachgroup

圖4 各組大鼠睪丸組織Cyt C、caspae-9蛋白相對表達(dá)量比較Fig.4 Comparison of relative expression of Cyt C and caspase-9 protein in testis of each group

3 討論

中醫(yī)文獻(xiàn)中并無精索靜脈曲張不育癥的病名，當(dāng)屬中醫(yī)學(xué)“筋瘤”“筋疝”等范疇。明·陳實(shí)功[13]《外科正宗》云：“筋瘤者，堅(jiān)而色紫，壘壘青筋，盤曲甚者結(jié)若蚯蚓?！鼻濉り愂胯I[14]《洞天奧旨·筋瘤骨瘤石瘤》中曰：“筋瘤者，乃筋結(jié)成于體上也。初起之時(shí)，必然細(xì)小，按之如筋也，筋蓄則曲，曲久成瘤而漸大矣?！逼涿枋雠cVC的臨床表現(xiàn)相似，而對于本病病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，中醫(yī)學(xué)尚未形成統(tǒng)一意見。導(dǎo)師崔云教授根據(jù)其多年臨床經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合經(jīng)絡(luò)學(xué)說及肝腎同源理論，認(rèn)為本病的病理機(jī)制當(dāng)為肝郁血瘀腎虛，并指出“肝郁”“血瘀”“腎虛”為本病發(fā)生發(fā)展的三大關(guān)鍵環(huán)節(jié)，貫穿本病的全程。肝氣郁結(jié)、氣失條達(dá)是男性不育關(guān)鍵之一，正如清·陳士鐸[15]在《石室秘錄·論子嗣》所云：“男不能生子者有六病……六病維何？一精寒也，一氣衰也，一精少也，一痰多也，一相火盛也，一氣郁也?！毖鍪潜静“l(fā)病的中心環(huán)節(jié)，肝氣郁結(jié)可致臟腑氣血功能紊亂，氣血運(yùn)行不暢，瘀血內(nèi)生，阻于精室，從而降低男性生殖能力。清·張錫純[16]在《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中認(rèn)為精室為“生精之處”和“化精之所”。腎虛為本病發(fā)病的核心，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎藏精，主生殖發(fā)育，因此腎與生育能力密切相關(guān)，男性不育癥主要責(zé)之于腎。腎之生殖之精要得以正?；?，必須有賴于氣血的旺盛與暢達(dá)，若氣血運(yùn)行不暢，血液瘀阻于精絡(luò)中，瘀久化毒，瘀毒內(nèi)蘊(yùn)，日久則外腎受損，生殖之精生成不足。因此，“肝郁”“血瘀”“腎虛”為導(dǎo)致精索靜脈曲張不育的三大關(guān)鍵因素。一方面，三者作為一個(gè)整體共同引起本病的發(fā)生；另一方面，三者之間又相互影響，互為因果，形成一個(gè)惡性循環(huán)。隨著病情的發(fā)展，年齡的增長，腎氣的衰退及診治是否得當(dāng)?shù)纫蛩氐挠绊?，又可形成本病反?fù)遷延，纏綿難愈的臨床特點(diǎn)?；诖耍瑢?dǎo)師崔云教授創(chuàng)立了治療VC不育癥的經(jīng)驗(yàn)方通精靈。通精靈由柴胡、丹參、紅花、菟絲子、五加皮、枸杞子、三七粉、炒露蜂房、煅龍骨、煅牡蠣組成，全方切合本病肝氣郁結(jié)、經(jīng)絡(luò)瘀阻、腎精不足之病機(jī)，寒溫并用、補(bǔ)澀兼施，共奏疏肝通絡(luò)、活血祛瘀、補(bǔ)腎強(qiáng)精之效。通精靈臨床效果顯著，可顯著改善VC患者術(shù)后精液質(zhì)量，提高其配偶妊娠率[17]?，F(xiàn)代藥理學(xué)也證實(shí)，方中主要中藥具有改善患者精子質(zhì)量、抗氧化、調(diào)控細(xì)胞凋亡等作用。

目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為VC可以引起睪丸組織損傷、睪丸生精障礙，從而降低男性生育能力。其相關(guān)分子機(jī)制包括睪丸微循環(huán)障礙、睪丸溫度差異的缺失、缺氧、氧化應(yīng)激、代謝產(chǎn)物反流堆積、免疫因素、生精細(xì)胞凋亡異常等，而上述分子機(jī)制又均與生精細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[18-20]。生精細(xì)胞凋亡異?？赡苁荲C致男性不育機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，發(fā)生VC時(shí)睪丸生精細(xì)胞凋亡增加，精子數(shù)量減少，從而導(dǎo)致不育[21]。張長城等[22]研究發(fā)現(xiàn)，采用左腎靜脈部分結(jié)扎法建立實(shí)驗(yàn)性VC大鼠模型后，各模型組中睪丸生精細(xì)胞凋亡數(shù)目及凋亡率明顯高于假手術(shù)組。筆者前期研究表明，VC模型大鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組[23]。本實(shí)驗(yàn)通過HE染色觀察到，模型組大鼠出現(xiàn)睪丸生精小管內(nèi)生精細(xì)胞排列紊亂、生精細(xì)胞脫落、管腔阻塞等明顯的病理損傷，而通精靈各劑量組睪丸組織中病理損傷明顯改善。TUNEL染色及Annexin V-FITC檢測發(fā)現(xiàn)，模型組生精細(xì)胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組；而通精靈中、高劑量組中睪丸生精細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組，這證實(shí)VC可導(dǎo)致睪丸組織病理損傷，影響生精細(xì)胞的凋亡，而通精靈可以有效改善這種病理損傷，防止生精細(xì)胞過度凋亡。

細(xì)胞凋亡被稱作Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡，是由基因控制的細(xì)胞自主、程序化的死亡方式。正常情況下，生精細(xì)胞凋亡是機(jī)體清除多余或受損的生精細(xì)胞方式之一，對于調(diào)控生精細(xì)胞數(shù)量，維持生殖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮重要作用[4]。目前已知細(xì)胞凋亡至少存在3種途徑，分別是線粒體途徑、死亡受體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[24]。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VC模型大鼠睪丸組織中抑制生精細(xì)胞凋亡的Bcl-2表達(dá)下調(diào)[22]，而 Bcl-2與線粒體Cyt C的釋放密切相關(guān)[25]。Cyt C是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，可以誘導(dǎo)蛋白水解和活化caspase級聯(lián)，是細(xì)胞凋亡過程的關(guān)鍵靶點(diǎn)。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)從線粒體途徑探討通精靈調(diào)控VC模型大鼠生精細(xì)胞過度凋亡的作用機(jī)制。正常情況下，Cyt C位于線粒體內(nèi)外膜之間，當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激后，Cyt C從線粒體內(nèi)釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡酶激活因子-1（apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1）分子結(jié)合，促使Apaf-1的構(gòu)象發(fā)生改變，caspase-9前體與Apaf-1氨基端結(jié)合，形成“凋亡小體”，在胞質(zhì)中脫氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate，dATP）的作用下進(jìn)一步激活。caspase-9是線粒體凋亡途徑中Cyt C下游重要的作用元件，參與了細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)，活化后的caspase-9能激活細(xì)胞凋亡執(zhí)行者caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26-28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組中大鼠睪丸組織中Cyt C和caspase-9的表達(dá)明顯升高，而通精靈中、高劑量組及左卡尼汀組中Cyt C和caspase-9的表達(dá)不同程度降低。說明通精靈可能是通過抑制線粒體Cyt C的釋放，下調(diào)caspase-9的表達(dá)，從而抑制VC模型大鼠生精細(xì)胞的過度凋亡。

綜上所述，通精靈可以有效改善VC大鼠睪丸組織的病理損傷，通過降低Cyt C和caspase-9的表達(dá)，調(diào)控caspase凋亡級聯(lián)反應(yīng)，減少生精細(xì)胞的凋亡，從而提高男性生育能力，這可能是通精靈治療VC不育的分子機(jī)制。相關(guān)文獻(xiàn)表明，Cyt C所介導(dǎo)的caspase凋亡級聯(lián)反應(yīng)，主要為凋亡相關(guān)蛋白間的相互作用，是相關(guān)蛋白構(gòu)象發(fā)生改變而帶來的結(jié)果；同時(shí)，蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行者，蛋白間相互作用才是執(zhí)行功能的主要途徑[28-29]。故本實(shí)驗(yàn)主要在蛋白水平對Cyt C和caspase-9的表達(dá)進(jìn)行了檢測，以期明確通精靈調(diào)控生精細(xì)胞凋亡的途徑。然而鑒于細(xì)胞凋亡途徑的多樣性，通精靈是否也可以通過其他途徑調(diào)控生精細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮中藥復(fù)方多靶點(diǎn)、多途徑、多效應(yīng)的作用優(yōu)勢，尚有待進(jìn)一步深入研究。