補(bǔ)陽還五湯調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化抑制大鼠腦缺血后炎癥反應(yīng)研究

甘海燕李琳楊琰諸葛陸杰儲(chǔ)利勝

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

缺血性腦卒中是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的疾病，也是成年人致死致殘的主要原因之一。腦缺血損傷的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其中繼發(fā)性炎癥反應(yīng)在腦缺血損傷中發(fā)揮重要作用[1-2]。小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia）是腦內(nèi)固有的免疫細(xì)胞，早期研究認(rèn)為腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞迅速被激活，并聚集到損傷部位，釋放炎癥介質(zhì)并募集其他炎癥細(xì)胞，加劇腦損傷[3-4]。

小膠質(zhì)細(xì)胞有靜息態(tài)和激活態(tài)，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞有經(jīng)典激活的M1型和替代激活的M2型兩種表型，與巨噬細(xì)胞在形態(tài)和表型上相似，兩者很難區(qū)分。近年來研究發(fā)現(xiàn)，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在腦缺血損傷中發(fā)揮損傷和修復(fù)的雙重作用[5-6]。其中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞釋放誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）以及促炎因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6） 和一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）等加劇神經(jīng)損傷，而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞釋放抗炎因子白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）以及胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）等，促進(jìn)炎癥消退和神經(jīng)修復(fù)。Hu等[7]研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后激活的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表型呈動(dòng)態(tài)改變，早期以M2型為主，隨后逐漸向M1型轉(zhuǎn)化。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞具有損傷和修復(fù)的雙重作用提示腦缺血治療應(yīng)從單純抑制小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞激活轉(zhuǎn)向調(diào)控M1/M2表型的平衡。

補(bǔ)陽還五湯（Buyang Huanwu Decoction,BYHWD）具有益氣活血通絡(luò)的功效，是中醫(yī)治療腦缺血的代表方劑。大量臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)BYHWD對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)和修復(fù)作用，機(jī)制包括抗氧化、抗凋亡、抗炎、促進(jìn)血管生成和神經(jīng)發(fā)生等[8-10]。本研究旨在從調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化角度探討B(tài)YHWD對(duì)腦缺血后神經(jīng)炎癥的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只，3～4月齡，體質(zhì)量280～300g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障實(shí)驗(yàn)室 [實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184]，環(huán)境溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%，光照12h/12h明暗交替，自由飲食。

1.2 藥物 補(bǔ)陽還五湯處方來自《醫(yī)林改錯(cuò)·卷下·癱痿》：“此方治半身不遂，口眼歪斜，語言蹇澀，口角流涎，大便干燥，小便頻數(shù)，遺尿不禁?！盵11]處方組成：黃芪 120g，當(dāng)歸 6g，川芎 4.5g，赤芍 4.5g，地龍 3g，紅花3g，桃仁3g，以上藥材均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬門診部。將藥物加水浸泡1h，水煎2次，每次40min，合并后濃縮為含生藥2g·mL-1的水煎液，冷卻后放置4℃冰箱保存。

1.3 試劑 兔抗Iba1購于日本W(wǎng)ako公司（批號(hào)：LKG5732）；鼠抗CD16/32購于美國BD公司（批號(hào)：5342941）；山羊抗CD206為美國RD公司產(chǎn)品（批號(hào)：WFT0116121）；FITC 標(biāo)記的羊抗兔二抗、Cy3 標(biāo)記的羊抗鼠二抗、FITC標(biāo)記的驢抗羊二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：123962、131209、125606）；Cy3 標(biāo)記的驢抗兔二抗購自美國Jackson ImmunoResearch公司（批號(hào)：711165152）；Triton X-100、DIPA、羊血清均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：13993V11、K172720E、C0205）；RNAiso Plus、SYBR Premix Ex TaqTM、Prime ScriptTMRT Master Mix、RNase-free Water均購自寶生物工程（大連）有限公司（批號(hào)：AA4301-1、AKA8605、AK5402、A3801A）。

1.4 主要儀器 冰凍切片機(jī)（美國 Thermo Fisher公司，型號(hào)：MH550）；倒置熒光顯微鏡（德國 Leica公司，型號(hào)：DMIL）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，型號(hào)：7500）；高速冷凍離心機(jī)（德國 Eppendorf公司，型號(hào)：Centrifuge 5424R）；RNA 反轉(zhuǎn)錄儀（美國BIO-RAD公司，型號(hào)：T100TMThermal Cycler）；紫外可見分光光度計(jì)（美國Thermo公司，型號(hào)：Nano drop 2000c）。

1.5 方法

1.5.1 大鼠局灶性腦缺血模型的建立 參照Longa等[12]的方法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。采用10%水合氯醛以350 mg·kg-1的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，依次分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎并游離頸外動(dòng)脈主干，在頸外動(dòng)脈剪一小口，經(jīng)頸外動(dòng)脈將栓線輕輕插入頸內(nèi)動(dòng)脈，當(dāng)尼龍線插入距頸總動(dòng)脈分叉18～20mm處時(shí)可感輕微阻力，停留90min后，將栓線輕輕拔出恢復(fù)血流灌注。結(jié)扎頸外動(dòng)脈，縫合皮膚。術(shù)中用加熱毯和白熾燈加熱，維持大鼠肛溫在37℃左右，術(shù)后將大鼠置于恒溫箱中直至蘇醒。假手術(shù)組，栓線只插入5mm左右。

1.5.2 大鼠分組與給藥 采用完全隨機(jī)法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、BYHWD 3組，每組10只。給藥劑量按人與動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量，BYHWD 組在缺血后 24h每日灌胃 13g·kg-1，1次/d，共14d[10]。假手術(shù)組和模型組灌服等容量的0.9%氯化鈉溶液。

1.5.3 免疫熒光雙標(biāo)染色檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表型 缺血模型建立后第14天，將大鼠麻醉后插管，經(jīng)左心室插管灌注0.9%氯化鈉溶液快速?zèng)_洗，4%多聚甲醛灌流固定，分離腦組織，經(jīng)后固定、脫水后，采用冰凍切片機(jī)制備8μm的切片。免疫熒光雙標(biāo)具體步驟：0.3%Triton X-100室溫破膜，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，分別加入M1型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物兔抗Iba1/鼠抗CD16/32（1:200），M2型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物兔抗I－ba1/山羊抗 CD206（1:100），4℃過夜后加入 FITC-羊抗兔/驢抗山羊和Cy3-羊抗鼠/驢抗兔標(biāo)記熒光二抗（1:100），室溫避光孵育1h，用含有DAPI的封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。每張切片任選不重復(fù)的3個(gè)視野，計(jì)數(shù)雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)，取平均值作為測(cè)量值。

1.5.4 qRT-PCR檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物 用Trizol法提取總RNA，根據(jù)TaKaRa公司SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照Takara SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系如下：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ 5.0μL、10μmoL·L-1上下游引物各0.4μL、50×ROX Reference DyeⅡ 0.2μL、cDNA 1.0μL、ddH2O 3.0μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。PCR反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。PCR引物引物均由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析 (Student-Newman-Keuls)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 BYHWD對(duì)大鼠腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞M1型極化的影響 免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示，大鼠局灶性腦缺血后第14天，與假手術(shù)組比較，模型組小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的M1型標(biāo)記物CD16/32表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；BYHWD組小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的CD16/32表達(dá)也顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，BYHWD組小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的M1型標(biāo)記物CD16/32表達(dá)顯著減少（P＜0.01）。見圖1。

2.2 BYHWD對(duì)大鼠腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞M2型極化的影響 免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示，大鼠局灶性腦缺血后第14天，與假手術(shù)組比較，模型組小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的M2型標(biāo)記物CD206表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與假手術(shù)組比較，BYHWD組的CD206表達(dá)也顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，BYHWD組小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的M2型標(biāo)記物CD206表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。見圖2。

圖1 BYHWD對(duì)腦缺血大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞M1型極化的影響（比例尺：50μm，400×）Fig.1 Effect of BYHWD on M1 polarization of microglia/macrophage after cerebral ischemia in rats(scale bar:50μm,400×)

2.3 BYHWD對(duì)大鼠腦缺血后M1型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記物mRNA表達(dá)的影響 大鼠腦缺血后第14天，qRT-PCR檢測(cè)提示，與假手術(shù)組比較，模型組 CD86、iNOS、TNF-α 和 IL-1β 的 mRNA 表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；BYHWD 組 CD86、IL-6的 mRNA表達(dá)顯著減少（P＜0.01），而 iNOS、TNF-α、IL-1β 的mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，BYHWD 組 CD86、iNOS、TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的mRNA表達(dá)顯著減少（P＜0.01）。見圖3。

圖2 BYHWD對(duì)腦缺血大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞M2型極化的影響（比例尺：50μm，400×）Fig.2 Effect of BYHWD on M2 polarization of microglia/macrophageafter cerebral ischemia in rats(scale bar:50μm,400×)

2.4 BYHWD對(duì)大鼠腦缺血后M2型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記物mRNA表達(dá)的影響 大鼠腦缺血后第14天，qRT-PCR檢測(cè)提示，與假手術(shù)組比較，模型組CD206、IL-10 mRNA 表達(dá)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），而Arg-1和TGF-β mRNA表達(dá)則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；BYHWD 組 CD206、Arg-1、IL-10 和 TGF-β mRNA表達(dá)均顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，BYHWD組CD206、Arg-1、IL-10和TGF-β mRNA 表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。見圖 4。

3 討論

BYHWD是中醫(yī)臨床治療腦缺血及其后遺癥的代表方劑。前期大量研究表明，BYHWD能夠促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)，減少梗死體積，其機(jī)制與抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)以及促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和血管生成等有關(guān)[8-10]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BYHWD促進(jìn)腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

圖3 BYHWD對(duì)大鼠腦缺血后M1型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記物mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effect of BYHWD on the mRNA expression of M1 microglia/macrophage markers after cerebral ischemia in rats

圖4 BYHWD對(duì)大鼠腦缺血后M2型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記物mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of BYHWD on the mRNA expression of M2 microglia/macrophage markers after cerebral ischemia in rats

生理情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞呈分枝狀，突起不斷伸縮監(jiān)視腦內(nèi)微環(huán)境，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。腦損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞迅速被激活，胞體變大，突起收縮呈阿米巴樣，并向損傷區(qū)遷移[3-4]。與巨噬細(xì)胞一樣，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞有M1和M2兩種表型。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)CD16/32、CD86、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ）和 i－NOS，釋放促炎因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、NO 和活性氧（reactive oxygen species，ROS）等加劇神經(jīng)損傷；而M2型高表達(dá)CD206、Arg1、Ym1以及抵抗素樣分子-α（resistin-like molecule-α，RELM-α），釋放抗炎因子IL-10和TGF-β，同時(shí)釋放IGF-1和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）等神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進(jìn)炎癥消退和神經(jīng)修復(fù)[5-6]。因此，本研究中選擇 CD16/32、CD86、iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6等作為M1型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記物，CD206、Arg-1、IL-10 和 TGF-β 等作為 M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記物。

Hu等[7]首次在大鼠局灶性腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)，缺血后1～3d，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量開始增加，3～5d達(dá)到高峰，7d開始減少，14d恢復(fù)到損傷前水平；而M1型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量在缺血后3d開始增加，持續(xù)到缺血后14d。在創(chuàng)傷性腦損傷和脊髓損傷中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[13]。因此，促進(jìn)腦損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化為腦損傷的治療提供了一個(gè)新思路[14]。隨后大量研究發(fā)現(xiàn)，藥物可通過促進(jìn)腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)換，以改善神經(jīng)功能。如：姜黃素[15]、紅景天苷[16]、二甲雙胍[17]、西地那非[18]等。本研究中免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，缺血后第14天，與模型組比較，BYHWD組小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的M1型標(biāo)記物CD16/32表達(dá)減少，而M2型標(biāo)記物CD206表達(dá)增加。qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步顯示，BYHWD抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86、iNOS以及其分泌的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)。相反，BYHWD促進(jìn)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD206、Arg-1及其分泌的抗炎因子IL-10和TGF-β mRNA表達(dá)，與免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果一致。上述結(jié)果提示，BYHWD促進(jìn)腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，從而抑制炎癥反應(yīng)。

此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞對(duì)神經(jīng)發(fā)生也有損傷和促進(jìn)的雙重作用[5-6]。其中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞通過釋放TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子對(duì)神經(jīng)發(fā)生起到損傷作用[19]，而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞通過分泌IGF-1和TGF-β等神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[20]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍、米諾環(huán)素和茶多酚等藥物誘導(dǎo)腦缺血后神經(jīng)發(fā)生與其促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化有關(guān)[17,21-22]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)BYHWD促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)功能恢復(fù)[9-10]，機(jī)制是否與其促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向M2型極化有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。

總之，本研究結(jié)果提示BYHWD可能通過促進(jìn)腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，從而抑制缺血再灌注炎癥反應(yīng)，但是BYHWD調(diào)控腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制以及意義尚待進(jìn)一步研究。